實(shí)驗——醬油種曲孢子數及發(fā)芽率的測定

一 醬油種曲孢子數

1 目的

    掌握應用血球計數板測定孢子數方法。

2 原理

    種曲是成曲的曲種，是保證成曲的關(guān)鍵，是釀制優(yōu)質(zhì)醬油的基礎。種曲質(zhì)量要求之一是含有足夠的孢子數量，必須達到6×109個(gè)/g（干基計）以上，孢子旺盛、活力強、發(fā)芽率達85%以上，所以孢子數及其發(fā)芽率的測定是種曲質(zhì)量控制的重要手段。測定孢子數方法有多種，本實(shí)驗采用血球計數板在顯微鏡下直接計數，這是一種常用的細胞計數方法。此法是將孢子懸浮液放在血球計數板與蓋片之間的計數室中，在顯微鏡下進(jìn)行計數。由于計數室中的容積是一定的，所以可以根據在顯微鏡下觀(guān)察到的孢子數目來(lái)計算單位體積的孢子總數。

    實(shí)驗中，稱(chēng)樣時(shí)要盡量防止孢子的飛揚。測定時(shí)，如果發(fā)現有許多孢子集結成團或成堆，說(shuō)明樣品稀釋未能符合操作要求，因此必須重新稱(chēng)重、振搖、稀釋。生產(chǎn)實(shí)踐中應用時(shí)，種曲通常以干物質(zhì)計算。

3 材料

3.1 樣品

    醬油種曲

3.2儀器和器具

蓋玻片，旋渦均勻器，血球計數板，電子天平，顯微鏡。 

3.3 試劑

    95%酒精，稀硫酸（1∶10）。

4 流程

    曲種→稱(chēng)量→稀釋→過(guò)濾→定容----制記數板----計算？

5 方法 

5.1樣品稀釋

    精確稱(chēng)取種曲1g（稱(chēng)準至0.002g），倒入盛有玻璃珠的250ml三角瓶?jì)�，加�?5%酒精5ml、無(wú)菌水20ml、稀硫酸（1:10）10ml，在旋渦均勻器上充分振搖，使種曲孢子分散，然后用三層紗布過(guò)濾，用無(wú)菌水反復沖洗，務(wù)使濾渣不含孢子，最后稀釋至500ml。

5.2制計數板

    取潔凈干燥的血球計數板蓋上蓋玻片，用無(wú)菌滴管取孢子稀釋液1小滴滴于蓋玻片的邊緣處（不宜過(guò)多），讓滴液自行滲入計數室中，注意不可有氣泡產(chǎn)生。若有多余液滴，可用吸水紙吸干，靜止5min，待孢子沉降。

5.3觀(guān)察計數

5.3.1 觀(guān)察

    用低倍鏡頭和高倍鏡頭觀(guān)察，由于稀釋液中的孢子在血球計數板上處于不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而計數時(shí)必須逐格調動(dòng)微調螺旋，才能不使之遺漏，如孢子位于格的線(xiàn)上，數上線(xiàn)不數下線(xiàn)，數左線(xiàn)不數右線(xiàn)。

5.3.2 計數

    使用16×25規格的計數板時(shí)，只計板上四個(gè)角上的4個(gè)中格（即100個(gè)小格），如果使用25×16規格的計數板時(shí)，除計四個(gè)角上的4個(gè)中格外，還需要計中央一個(gè)中格的數目（即80個(gè)小格）。每個(gè)樣品重復觀(guān)察計數不少于2次，然后取其平均值。

5.4計算

（1）16×25的計數板  

孢子數（個(gè)/g）=(N/100) ×400×10000×(V/G)=4×10⁴×(NV/G)…………（1）

                       式中  N——100小格內孢子總數 （個(gè)）

                             V——孢子稀釋液體積 （ml）

                             G——樣品重量  （g）

（2） 25×16的計數板

孢子數（個(gè)/g）=(N/80) ×400×10000×(V/G)=5×10⁴×(NV/G) …………………………（2）

                       式中  N——80小格內孢子總數 （個(gè)）

                             V——孢子稀釋液體積 （ml）

                             G——樣品重量 （g）

5 流程

曲種→稱(chēng)量→稀釋→過(guò)濾→定容→制計數板→觀(guān)察計數→計算

6 結果

    樣品稀釋至每個(gè)小格所含孢子數在10個(gè)以?xún)容^適宜，過(guò)多不易計數，應進(jìn)行稀釋調整。結果記入下表。

計算次數    各中格孢子數    小格平均孢子數    稀釋倍數    孢子數

（個(gè)/g）    平均值

第一次                    

第二次                    

7 思考

用血球計數板孢子計數有什么優(yōu)缺點(diǎn)？

二 孢子發(fā)芽率測定法

1 目的

  學(xué)習孢子發(fā)芽率的測定方法

2 原理

    測定孢子發(fā)芽率的方法常有液體培養法和玻片培養法，部頒標準采用玻片培養法。本實(shí)驗應用液體培養法制片在顯微鏡下直接觀(guān)察測定孢子發(fā)芽率。孢子發(fā)芽率除受孢子本身活力影響外，培養基種類(lèi)、培養溫度、通氣狀況等因素也會(huì )直接影響到測定的結果。所以測定孢子發(fā)芽率時(shí)，要求選用固定的培養基和培養條件，才能準確反映其真實(shí)活力。

3 材料

3.1 樣品

    種曲孢子粉

3.2 培養基

    察氏液體培養基

3.3 儀器和器具

    載玻片、蓋玻片、顯微鏡，接種環(huán)，酒精燈，恒溫搖床

4 流程

種曲孢子粉→接種→恒溫培養→制標本片→鏡檢→計數

5 方法

5.1 接種  

    用接種環(huán)挑取種曲少許接入含察氏液體培養基的三角瓶中，置于30℃下?lián)u床振蕩恒溫培養3—5 h。

5.2 制片

    用無(wú)菌滴管取上述培養液于載玻片上滴一滴，蓋上蓋玻片，注意不可產(chǎn)生氣泡。

5.3 鏡檢

    將標本片直接放在高倍鏡下觀(guān)察發(fā)芽情況，標本片至少同時(shí)做二個(gè)，連續觀(guān)察兩次以上，取平均值，每次觀(guān)察不少于100個(gè)孢子發(fā)芽情況。

54 計算

    發(fā)芽率（%）=A/（A+B）×100

        式中   A——發(fā)芽孢子數 （個(gè)）

               B——未發(fā)芽孢子數 （個(gè)）

6 結果

6.1正確區分孢子的發(fā)芽和不發(fā)芽狀態(tài)。

6.2培養前要檢查調整孢子接入量，以每個(gè)視野含孢子數10—20個(gè)為宜。

6.3 實(shí)驗結果記入下表

 

孢子發(fā)芽數（A）    發(fā)芽和未發(fā)芽孢子數（A+B）    發(fā)芽率（%）    平均值

                   

7 思考

影響孢子發(fā)芽率的因素有哪些？哪些實(shí)驗步驟容易造成結果誤差？