制劑無(wú)菌檢查及微生物限度檢查方法學(xué)驗證及驗證結果的技術(shù)評價(jià)（2）

微生物限度檢查中的菌數計數屬于定量實(shí)驗。驗證試驗是通過(guò)對加入的各種規定微生物的回收率試驗來(lái)進(jìn)行的。驗證中可以?xún)H選用在How3 已確定的敏感菌作試驗，這樣可減少工作量，因為能滿(mǎn)足敏感菌生長(cháng)的條件必然能滿(mǎn)足其他菌的生長(cháng)。也可以完全按藥典規定，逐一進(jìn)行每種試驗菌的驗證：對每種試驗菌均應建立 （1）試驗組（供試液加菌液組）——菌數計數測得CFU1 、（2）菌液組 ——菌數計數測得CFU2 、（3）供試液本身對照組 ——菌數計數測得CFU3 、（4）稀釋劑對照組 ——菌數計數測得CFU4 。 驗證試驗和對驗證結果技術(shù)評價(jià)的判斷為：應符合 CFU4 ÷ CFU2 ≥70 ％（CFU 1 －CFU3 ）÷ CFU2 ≥70 ％

如兩個(gè)回收率均≥70 ％，則說(shuō)明所用方法已消除了供試品的抑菌活性�？梢源_定按該方法進(jìn)行該品種的菌數計數檢查；如回收率小于70 ％，則說(shuō)明仍有抑菌活性，應考慮進(jìn)一步采取適宜的措施以消除抑菌活性，并重新驗證，直至驗證結果回收率均≥70 ％證明已充分消除或有效降低抑菌活性為止。

微生物限度檢查中的控制菌檢查屬于定性試驗。在驗證試驗中，應同時(shí)設置：（1）目標菌陽(yáng)性對照管、（2）供試品＋目標菌管、（3）陰性對照管、（4）非目標菌對照管。驗證試驗和對驗證結果技術(shù)評價(jià)的判斷為：

（1）目標菌陽(yáng)性對照管菌必須生長(cháng)良好、（2）供試品＋目標菌管生長(cháng)良好、（3）陰性對照管必須無(wú)菌生長(cháng)、（4）陰性菌對照必須無(wú)菌生長(cháng)” 則說(shuō)明試驗成立，并且所用方法已消除或充分減低了供試品的抑菌活性�？梢源_定按該方法進(jìn)行該品種的控制菌檢查；如出現“（2）供試品＋目標菌管生長(cháng)緩慢、或不生長(cháng)”則說(shuō)明仍有抑菌活性，應考慮進(jìn)一步采取適宜的措施以消除抑菌活性，并重新驗證，直至驗證結果中（2）供試品＋目標菌管與（1）目標菌陽(yáng)性對照管相同，證明已充分消除或有效降低抑菌活性為止。

如出現“（3）陰性對照管有菌生長(cháng)、（4）陰性菌對照管有菌生長(cháng)”則說(shuō)明實(shí)驗不成立，所用方法不專(zhuān)屬。應尋找原因并重新驗證試驗。

通過(guò)以上4 個(gè)步驟的驗證試驗實(shí)踐，綜合分析實(shí)驗中遇到的所有情況和所采取的方法，原始、真實(shí)地記錄下來(lái)形成一份詳細的、具有可操作性和重現性的驗證報告。并在產(chǎn)品的質(zhì)量標準中【無(wú)菌】或【微生物限度】項下明確經(jīng)驗證試驗確定的檢驗操作方法：明確樣品前處理方法、步驟，判斷有無(wú)抑菌活性的依據，消除抑菌活性采用的具體方法，以及各方法操作的關(guān)鍵點(diǎn)等。

四、什么時(shí)候驗證 (when)

（1）當建立藥品的微生物學(xué)檢查方法時(shí)�！�—即當申報新藥時(shí)必須附有進(jìn)行微生物學(xué)檢查的方法學(xué)驗證的資料。并在藥品質(zhì)量標準的【無(wú)菌】或【微生物限度】項下明確經(jīng)驗證試驗4確定的檢驗操作方法。

（2 ）產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時(shí)�！�—考察這些改變對微生物生長(cháng)的影響。

（3 ）定期再驗證 ——考察驗證結果的穩定性和及時(shí)發(fā)現影響微生物生長(cháng)的因素。

（4 ）可與產(chǎn)品的微生物學(xué)檢查同時(shí)進(jìn)行。

五．方法學(xué)驗證結果和驗證報告的技術(shù)評價(jià)

1 、藥檢所審核企業(yè)提交的驗證材料時(shí)如何審核？——通過(guò)所報敏感菌來(lái)驗證結果的可靠性。

2 、新藥注冊審評時(shí)如何評價(jià)驗證材料？

（1）首先按給藥途徑確定被審品種應符合無(wú)菌檢驗還是微生限度檢查，確定驗證項目。

（2）如應做微生物限度檢查，確定該品種規定的微生物限度標準，再確定應驗證哪些項目。

（3）根據上述開(kāi)展驗證的思路和程序進(jìn)行審核。

（4）一份技術(shù)含量高的驗證材料和驗證結果應能很好地回答出上文所指出的4 個(gè)W 。特別是其中的what 和how 的內容：

樣品的前處理方法的合理性，及方法不影響微生物生長(cháng)的證明；

有判斷供試品有抑菌性、抑什么菌的依據、資料、實(shí)驗記錄證明；

如證明有抑菌性，最敏感菌是那個(gè)？

審核所選消除抑菌性的方法，及其合理性、有效性的證明。

檢查經(jīng)驗證所確定的檢驗方法和條件是否能滿(mǎn)足最敏感菌的要求？等方面。

（5 ）關(guān)注中檢所驗證實(shí)驗信息交流平臺WWW.antibiotic.cn ，了解當前的一些新動(dòng)向。如：乳膏類(lèi)制劑的前處理用Bacl2 溶液作破乳劑、用Mnso4 作為喹諾酮類(lèi)藥品的中和劑、和其他有效中和劑的開(kāi)發(fā)使用信息等新方法的合理性和有效性考察資料。提高對驗證進(jìn)行技術(shù)評價(jià)的能力。

3 、一份標準的技術(shù)性驗證報告應由以下部分組成：

一、實(shí)驗目的

二、樣品信息

三、驗證方案（初步驗證方案、重新驗證方案，糾正原因）和方案的批準。

四、儀器與實(shí)驗材料(培養基、菌種、儀器、設備)

五、方法驗證(方法依據、供試菌液制備、菌液計數、敏感菌選擇、所用方法考察、方法驗證步驟、實(shí)驗原始記錄)。

六、驗證結論。

七、【檢查】項下【無(wú)菌】或【微生物限度】 具體方法確定。

八、實(shí)驗員簽名、驗證報告批準人簽名。

4 、用語(yǔ)規范。

注[1 ] 要求執行驗證的相關(guān)法規和文件

為了確保開(kāi)展微生物學(xué)檢驗方法的驗證，國食監注〔2005 〕234 號“關(guān)于頒布和執行《中國藥典》2005 年版有關(guān)事宜的通知” 國藥典發(fā)〔2005 〕98 號“關(guān)于執行《中國藥典》2005年版微生物限度檢查法和無(wú)菌檢查法有關(guān)問(wèn)題的說(shuō)明”中檢藥〔2006 〕862 號“第七屆全國藥品檢驗所抗生素室主任工作會(huì )議暨全國藥品微生物檢驗方法及標準研討會(huì )會(huì )議紀要”都作了說(shuō)明和規定。

[作者簡(jiǎn)介] 錢(qián)維清，女，主任藥師，從事藥品微生物檢驗及質(zhì)量控制。