制劑無(wú)菌檢查及微生物限度檢查方法學(xué)驗證及驗證結果的技術(shù)評價(jià)（1）

 2005 年版藥典無(wú)菌檢查法和微生物限度檢查法的最重大增訂是要求對檢驗方法進(jìn)行驗證，及對驗證方法給出了系統的規定。 這是我國藥品微生物學(xué)檢查方法與先進(jìn)國家藥典接軌、符合國際人用藥品注冊技術(shù)要求協(xié)調會(huì )（ICH ）的要求、邁向科學(xué)化、合理化的一個(gè)重要標志，也是促進(jìn)我國藥品微生物學(xué)檢查標準化建設的重要途徑。為了確保開(kāi)展微生物學(xué)檢驗方法的驗證，國家局、藥典會(huì )、中檢所都先后發(fā)布了要求執行驗證的相關(guān)法規和文件[1]

一、驗證的必要性和意義（Why）

1 、隨著(zhù)科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，藥品質(zhì)量標準中的鑒別、有關(guān)物質(zhì)、含量測定等項的檢測方法都不斷地在精密度、準確度上逐步提高。但2005 年版以前的藥典對藥品微生物污染檢查方法的準確性、可靠性基本無(wú)要求，造成長(cháng)期來(lái)在藥品生產(chǎn)工藝、藥品檢驗、藥品技術(shù)審評中對與人民用藥安全有效密切相關(guān)的微生物污染監控、監測方法缺乏警惕和衡量的標準，與先進(jìn)國家的藥典和藥品技術(shù)審評要求脫節。

2 、對所用的檢驗方法進(jìn)行驗證，是分析測量科學(xué)的基本要求，是各種法規遵循工作的基礎。藥品微生物學(xué)的檢查作為整個(gè)藥品質(zhì)量體系中的一個(gè)環(huán)節，也應與化學(xué)分析的嚴謹要求靠攏，保證檢驗結果的準確可靠。

3 、通過(guò)驗證試驗，可對每種藥品的具體檢驗方法的可靠性及結果的準確性予以確認，從而形成標準化的操作。這是促進(jìn)藥品無(wú)菌、微生物限度檢查走向標準化的重要途徑。

4 、通過(guò)對同品種但不同批號或不同生產(chǎn)廠(chǎng)家的產(chǎn)品的微生物學(xué)驗證試驗比較，可以發(fā)現產(chǎn)品所用原料質(zhì)量或工藝流程中是否存在污染抑菌物質(zhì)的問(wèn)題，具有藥品質(zhì)量控制的意義。

二、開(kāi)展驗證的思路和程序

1 首先了解供試品是否有抑菌性、抑什么菌。

2 考慮和選擇出適當的方法消除或降低供試品的抑菌性。

3 用實(shí)驗證明你所用的方法已消除抑菌性——能使人工加入的各種試驗菌生長(cháng)良好。特別是能滿(mǎn)足對產(chǎn)品最敏感菌的生長(cháng)。

4 將所作實(shí)驗記錄在案—— 即為確認該供試品在該檢驗量，在該檢驗條件下已充分消除抑菌性，能確保實(shí)驗結果正確可靠的驗證試驗結果報告。

以上4 點(diǎn)思路和程序也是對驗證報告進(jìn)行技術(shù)評價(jià)和審核時(shí)必須注意和考察的4 點(diǎn)。

三、驗證的重點(diǎn)是什么？（what ）

無(wú)菌、微生物限度檢查的驗證試驗可概括描述為：在采用的檢驗方法和過(guò)程中，通過(guò)分別加入規定量的代表性微生物，以試驗供試品是否在規定的檢驗量、在所采用的檢驗條件下1ഊ無(wú)抑菌性，或已充分消除了抑菌性（供試品本身的以及操作系統中可能對微生物生長(cháng)有影響的各種因素），并且所用方法對微生物生長(cháng)無(wú)不良影響，從而確認檢驗方法的有效性，保證檢驗結果的準確可靠。因此，整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節均應有合理的證明，保證其對結果判斷沒(méi)有影響。按樣品的檢驗流程，驗證的重點(diǎn)環(huán)節分布如下：

樣品

需前處理

不需前處理

有抑菌作用

無(wú)抑菌作用

去除抑菌作用

①驗證前處理方法對污染菌生長(cháng)、檢出的影響。

③驗證抑菌活性去除方法的有效

性及對污染菌檢出無(wú)影響。

②通過(guò)驗

證實(shí)驗判

檢驗

What1 ：驗證制成適宜供試液的前處理方法，證明方法對微生物生長(cháng)、檢出無(wú)影響。

What2 ：驗證樣品有無(wú)抑菌性、抑什么菌 ？最敏感的菌是那一個(gè)？其結果將直接影響

下續檢驗方法的選擇和操作步驟的進(jìn)行，并是最終所選檢驗方法和操作步驟合理性的證明。

What3 ：驗證消除樣品抑菌活性的方法，證明方法的有效性及方法對污染菌生長(cháng)無(wú)影響。

如何選擇合理、適宜、簡(jiǎn)單有效的消除抑菌活性的方法是當前驗證工作的關(guān)鍵。

驗證報告對以上3 個(gè)環(huán)節的情況是否都有交待；所采用的方法是否科學(xué)、合理、有效，并且提供了實(shí)驗的證明，也是對驗證報告進(jìn)行技術(shù)評價(jià)和審核時(shí)必須注意考察的3 點(diǎn)。

四、怎么驗證？（How ）

按藥典對樣品無(wú)菌檢查的規定和要求，或是微生物限度檢查的規定和要求進(jìn)行，對每一試驗菌應逐一進(jìn)行驗證試驗。微生物學(xué)的驗證試驗一般分 4 個(gè)步驟進(jìn)行：

1 、制備驗證試驗用菌液——How1 ：

按藥典無(wú)菌檢查法中培養基靈敏度檢查項中試驗用菌液制備的方法將規定需用的試驗菌分別制成每毫升中含10 ～100 個(gè)菌（CFU ）的供試菌液。驗證報告中應給出各種試驗用菌液的制備和菌液含菌量計數的原始記錄。

2 、樣品的前處理方法——How2 ：

為達到制備成均勻的供試液及為后續采取消除抑菌活性的方法作準備，將所采取的前處理方法應用和參加到驗證試驗中，以證明所用處理方法對各試驗菌的生長(cháng)無(wú)影響。

按供試品的性狀選用以下適宜的方法，或幾種方法聯(lián)合使用：

溶解：—— 驗證所用溶液、助溶劑和水浴助溶溫度對微生物生長(cháng)無(wú)影響。

乳化：—— 驗證所用乳化劑和水浴助溶溫度的有效性、使用量及對微生物生長(cháng)無(wú)影響。

破乳：—— 驗證所用破乳劑的有效性、使用量及對微生物生長(cháng)無(wú)影響。

萃�。骸�— 驗證有機相選擇的合理性、有效性及對微生物生長(cháng)無(wú)影響。

2稀釋?zhuān)骸��?nbsp;驗證降低供試品相對抑菌濃度的有效稀釋倍數。

離心：—— 驗證所用轉速、時(shí)間和微生物的分布情況。

驗證報告中應有采取某種前處理方法的原因有說(shuō)明，并記錄操作步驟以增加重現性。樣品如不需要特別的前處理就能制成均勻的供試液，那么這一步驟可省掉，直接進(jìn)入確定樣品有無(wú)抑菌性的How3

3 、確定供試品是否有抑菌性、抑什么菌——How3 ：

可通過(guò)查閱臨床藥物實(shí)驗手冊、文獻資料（特別是雜志“Drug”，每一種新藥上市，都有專(zhuān)門(mén)的綜述）、申報資料中的藥效學(xué)資料，關(guān)注其對不同細菌的MIC 情況、參考已經(jīng)驗證過(guò)的品種、抗菌藥物可根據抗菌譜確定其敏感菌、中成藥如果抗菌譜不清楚，至少需選擇一株細菌和一株真菌來(lái)試驗等方法。也可直接通過(guò)驗證實(shí)驗確定之。

用實(shí)驗確定是否具有抑菌性的方法：在規定量的供試液中加入實(shí)驗用微生物10~100 個(gè)，如微生物生長(cháng)良好，即說(shuō)明供試品對該種微生物無(wú)抑菌活性。如已用藥典規定的各試驗菌試驗，結果均能生長(cháng)良好，說(shuō)明供試品無(wú)抑菌性，可用常規方法檢驗之。 將這些試驗記錄在案——就是證明該供試品無(wú)抑菌性的驗證試驗部分；如加入的微生物不生長(cháng)或生長(cháng)緩慢，說(shuō)明供試品有抑菌性，將這些試驗記錄在案——就是證明該供試品有抑菌性的驗證試驗部分；如加入的微生物中有某一種菌最不能生長(cháng)或生長(cháng)最緩慢，這一種菌就是該樣品的敏感菌。

4 、選擇適當的方法消除或有效降低供試品的抑菌活性——How4 ：

根據供試品特性選擇藥典規定的消除供試品抑菌活性的方法（一種或幾種聯(lián)合），或利用藥物化學(xué)知識，尋找出其他合理、有效的方法，特別是有效的中和劑（這是值得鼓勵的發(fā)展方向）。并通過(guò)模擬實(shí)驗（驗證試驗）對消除或降低抑菌活性的效果加以檢驗。

無(wú)菌檢查中可采用：① 薄膜過(guò)濾法 ② 中和法（目前藥典僅收載β－內酰胺酶處理法）。

①薄膜過(guò)濾法——適用于液體供試品和可溶于水的固體供試品（只要性狀許可，應首先采用）。驗證和對驗證結果技術(shù)評價(jià)的重點(diǎn)是：確定濾膜的適用性、確定沖洗的方法和沖洗液的用量。

②中和法——適用于有對應性，能充分被其滅活抑菌活性的樣品（如β－內酰胺酶滅活β－內酰胺類(lèi)抗生素、對氨基苯甲酸滅活磺胺類(lèi)）。驗證和對驗證結果技術(shù)評價(jià)的重點(diǎn)是：

確定中和劑的有效、證明對污染微生物的生長(cháng)無(wú)毒性、加入的方法和加入量。

在檢驗制劑是否已消除或降低抑菌活性的驗證試驗中，每種試驗菌為一組，每組兩管，其中一管為供試品加試驗菌管，另一管為試驗菌對照管。

驗證試驗和對驗證結果技術(shù)評價(jià)的判斷為：如平行3 次的試驗中，各管微生物均生長(cháng)良好，說(shuō)明供試品已消除了抑菌活性�？梢源_定按該方法進(jìn)行該品種的無(wú)菌檢查；如有供試品管的微生物生長(cháng)微弱、緩慢或不生長(cháng)，說(shuō)明供試品仍有抑菌活性，應考慮進(jìn)一步增加沖洗量或中和劑的用量以消除抑菌活性，并重新驗證，直至驗證證明已充分消除或有效降低抑菌活性。

微生物限度檢查中可采用：

① 培養基稀釋法 ② 離心沉淀法 ③ 薄膜過(guò)濾法 ④ 中和法。

①培養基稀釋法——取規定量的供試品/供試液加至較大量的培養基中，使單位體積內的供試品濃度降低至不顯抑菌作用。適用于不能用薄膜過(guò)濾法而且抑菌活性較弱的樣品。驗證和對驗證結果技術(shù)評價(jià)的重點(diǎn)是：確定培養基量增加至多少才能使供試品/供試液不顯抑菌活性。

②離心沉淀法——利用沉降系數差異分離去掉藥渣、含抑菌活性的部分，留下含微生物的部3分。適用于不能用薄膜過(guò)濾法等方法的樣品。驗證和對驗證結果技術(shù)評價(jià)的重點(diǎn)是：確定能將藥渣、抑菌成分部位分離掉而留下微生物部位的有效的離心率。

③薄膜過(guò)濾法——同上無(wú)菌檢查法中所述。并�？膳c離心沉淀法聯(lián)合使用消除抑菌活性。

④中和法——同上無(wú)菌檢查法中所述。

實(shí)踐證明幾種方法聯(lián)合使用效果更好。其中薄膜過(guò)濾法和中和法是最有效的消除抑菌性

的方法。驗證報告中應對樣品所采取的某種消除抑菌性的方法的原因有說(shuō)明，并詳細記錄操作重點(diǎn)和步驟以增加重現性。

由于制劑的微生物限度檢查由菌數計數和控制菌檢查兩部分組成，所以，在檢驗是否已消除或有效降低抑菌活性的試驗中也應分別進(jìn)行驗證。