副豬嗜血桿菌病病原菌的分離與鑒定

副豬嗜血桿菌病病原菌的分離與鑒定，為預防該病， 國內外雖然研制了各種類(lèi)型的基因工程菌苗與多價(jià)滅活菌苗，但由于副豬嗜血桿菌血清型眾多，各個(gè)地方的流行菌株各不相同，各個(gè)血清型之間的交叉保護性不高，菌苗的免疫效果并不理想。筆者對長(cháng)治市某大型豬場(chǎng)的副豬嗜血桿菌進(jìn)行了分離和鑒定，以便選擇針對性較強的菌株作為菌苗株，以起到更好的預防效果，并為副豬嗜血桿菌病的進(jìn)一步研究奠定基礎。

 

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)引起豬的多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節炎，該病又稱(chēng)為革拉澤氏病(Glasser’SDisease)，影響從2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病。通常見(jiàn)于5～8周齡的豬，發(fā)病率一般在10％～15％，嚴重時(shí)死亡率可達到50％。主要臨床癥狀表現為咳嗽，呼吸困難，消瘦，跛行和被毛粗亂；主要剖檢病變表現為胸膜炎，心包炎，腹膜炎，關(guān)節炎和腦膜炎等。隨著(zhù)世界養豬業(yè)的發(fā)展，該病已成為全球范圍內影響養豬業(yè)的典型細菌性疾病。由于飼養技術(shù)的調整以及突發(fā)新的呼吸道綜合征，使得該病日趨流行，危害日漸嚴重。近年來(lái)，隨著(zhù)養殖水平的提高，副豬嗜血桿菌在我國各豬場(chǎng)引起多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節炎的報道屢見(jiàn)不鮮，其損失相當慘重。

 

 

 

1材料與方法

 

1．1病料的采集對2個(gè)病死仔豬進(jìn)行尸體解剖(應無(wú)菌操作)，打開(kāi)胸腔和腹腔，首先吸取積液或以棉簽拭取胸膜及腹膜粘附物，然后再取內臟，內臟器官須實(shí)驗室無(wú)菌操作，以灼燒過(guò)的手術(shù)刀燙烙剖面，取深層組織涂板培養。

 

1．2主要培養基本試驗選擇以下配方：胰蛋白胨0．6g、酵母浸出粉1．0g、可溶性淀粉0．25g、枸椽酸鈉0．15g、普通營(yíng)養瓊脂粉4．5g。加蒸餾水至lOOmL，溶解后調pH至7．2～7．4，然后高壓上述混合物，120％，15min。在水浴中冷卻至80％。加10mL無(wú)菌脫纖綿羊血，在80％水浴中漩搖10～15min。在冷卻至50％時(shí)，加入無(wú)菌輔酶I(NAD)至15g／mL，加入萬(wàn)古霉素至50g／mL。傾倒大約4mm厚平皿，冷卻后4℃保存備用。

 

1．3病原分離及純化從分離培養的瓊脂平板上挑取灰白或透明、光滑呈露珠樣的菌落，巧克力瓊脂平板單菌落劃線(xiàn)培養。48h后細菌涂片，革蘭氏染色鏡檢。如果為革蘭氏陰性小桿狀或多形性小桿菌，再進(jìn)行一次巧克力瓊脂亞克隆培養，同時(shí)接種鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板。巧克力瓊脂平板生長(cháng)良好，而鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板沒(méi)有菌落生成則菌株保存待進(jìn)一步鑒定。經(jīng)初步篩選的分離株CZ株。

 

 

 

1．4染色鏡檢挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察細菌的形態(tài)特點(diǎn)。

 

1．5生化特性

 

1．5．1V因子需要試驗v因子為輔酶I即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，是細菌呼吸過(guò)程中起遞氫作用的兩種脫氫輔酶。挑取被檢分離株和副豬嗜血桿菌標準株菌落接種兔鮮血瓊脂平板和2％胨瓊脂平板上，再以金黃色葡萄球菌點(diǎn)種或垂直劃線(xiàn)，置37％培養48h。觀(guān)察葡萄球菌菌落周?chē)�菌落生成情況，愈靠近金黃色葡萄球菌菌落生成的半透明菌落愈大，愈遠的愈小，甚至不見(jiàn)菌落生長(cháng)，該現象即稱(chēng)為“衛星現象”。

 

1．5．2X因子需要試驗x因子是血紅蛋白中的血紅素及其衍生物，含鐵卟啉，121℃高溫下30min不被破壞，是細菌合成細胞色素、細胞色素氧化酶、觸酶和過(guò)氧化物酶等的輔基。挑取被檢分離株和副豬嗜血桿菌標準株菌落接種2％胨瓊脂平板上，再分別貼上浸漬有x、V、X+V因子的圓形濾紙片。如果只有含X+V因子的紙片周?chē)�有菌落生長(cháng)，則表明該菌株既依賴(lài)x因子又依賴(lài)V因子。如果只有含V、X+V因子的紙片周?chē)�有菌落生長(cháng)，則表明該菌株只依賴(lài)V因子不依賴(lài)X因子。

 

1．5．3生化實(shí)驗脲酶、葡萄糖發(fā)酵、樹(shù)膠醛糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、甘露糖發(fā)酵、蜜三糖發(fā)酵、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗等，采用以下培養基基質(zhì)或者商品生化反應試劑加入以下特殊培養基成份。配方：BiosatePeptone(BBL)10mg、NaC110mg、酚紅0．04mg、高級瓊脂15mg、蒸餾水900mL�；旌霞訜崛芙�，冷后調節pH7．5后分裝于密封的瓶子內，121℃15min。這方法可用于大量或微量試驗。

 

2結果

 

2．1病原的分離及染色鏡檢CZ株為革蘭氏陰性小桿狀或多形性小桿菌，符合副豬嗜血桿菌的形態(tài)特征。

 

3討論

 

3．1在加抗菌素的選擇培養基上接種培養，用特殊的稀釋方法可以提高副豬嗜血桿菌的分離成功率5％CO!或蠟罐培養并不能提高副豬嗜血桿菌的生長(cháng)速度，用脫纖維蛋白的血和胰蛋白胨血液瓊脂基質(zhì)培養成分可以提高生長(cháng)速度；用�；蜓蜓�和胰酶水解酪蛋白瓊脂為培養基效果不佳。

 

3．2疾病發(fā)生時(shí)期，畜主多采州抗生素治療，效果往往不理想，其主要原因是副豬嗜血桿菌的耐藥性產(chǎn)生、毒素作用或多種病原混合感染�？股�素的使用給副豬嗜血桿菌的分離造成極大不便，使我們無(wú)法確認采集來(lái)的標本中是存在副豬嗜血桿菌。

 

3．3金黃色葡萄球菌等產(chǎn)色素的細菌及酵母茵在生長(cháng)產(chǎn)過(guò)程中可合成v因子，并在培養基中擴散，滿(mǎn)足v子依賴(lài)性細菌的生長(cháng)需求，所以出現衛星現象。衛星現象的產(chǎn)生可以用來(lái)鑒別剮豬嗜血桿菌的v因子依賴(lài)性。

 

3．4嗜血桿菌屬的多數細菌生長(cháng)需要供給x子但副豬嗜血桿菌生長(cháng)不需要x因子。如果只有含V、X+V因子的紙片用有菌落生長(cháng)，則表明該菌株只依賴(lài)V因子不依賴(lài)x因子。本實(shí)驗中出現v因子依賴(lài)性的前提下，x因子依賴(lài)陽(yáng)性的可以否定是副豬嗜血桿菌。

 

3．5南于副豬嗜血桿菌有較高的培養要求，其生化實(shí)驗的關(guān)鍵是特殊培養基基質(zhì)的選擇，或者商品生化反應管的營(yíng)養改良。m清、NAD等成份的加入可以保證副豬嗜血桿菌的培養成功，但是必須保證加入的成份不改變生化試劑的PH值等生化特性。