輸血相關(guān)病毒母嬰傳播的分子病毒學(xué)的臨床研究

【摘要】 目的 了解輸血相關(guān)病毒（TTV）在我國母嬰傳播的可能及分子病毒學(xué)依據 方法 應用PCR調查我院2002年1～12月間住院的174例產(chǎn)婦及其新生兒的TTV感染情況，用克隆后序列分析測定兩對母嬰同時(shí)陽(yáng)性者TTV基因序列。結果 在174例產(chǎn)婦中有24例用半巢式PCR可檢測出TTV，檢出率 13.8%，其中4例產(chǎn)婦與新生兒同時(shí)陽(yáng)性（4.6%）;配對比較兩對母嬰TTV序列片段（1915～2185核苷酸片段）同源性均為100%。結論 TTV在我國可通過(guò)母嬰傳播的途徑感染，此結果豐富了對TTV傳播途徑的認識。TTV對胎兒的危害及新生兒生長(cháng)發(fā)育的影響值得進(jìn) 步研究。

　　TTV transmission from mother to infant  

　　Chen Yong，Du Jianping

    

　　Dept.of Blood Transfusion of He-Ze Municipal Hospital，Shandong274000.

     

　　【Abstract】 Objective Mother to infant transmission of a novel virus named TT virus was investigated in sera from174mothers and their infants.24cases（13.8%）of the mothers were found to harbor TTV in serum by a semˉinested PCR using a set of primers from conserved region in the TTV genome.Among them there were4infants and their born mothers possessed positive sequences simultaneously（4.6%）.We carried out cloning sequencing of the amˉplicons with BAI310automated sequencer using primer T7or SP6as sequencing primers.Homology analysis was done with sequences between positions1915and2185of the published TTV genome.Analysis of TTV sequences from the infected mother and their infected child confirmed a genetic link between the virus of the mother and the infected child.This study indicates there is a possibility of mother to infant transmission of TTV in China.

　　Key words mother to infomt tromsmission TTV virus  

　　1997年國外學(xué)者發(fā)現了一 可能與輸血后肝炎相關(guān)的病毒（即TTV）［1～3］  。國內在某校學(xué)生暴發(fā)流行的一次以單項轉氨酶升高為特點(diǎn)的肝炎患者的血清與糞便中也檢測出該病毒，證實(shí)了國內TTV感染的存在 ［4］  。進(jìn)一步的研究發(fā)現在自然人群、各型肝炎患者、暴露于血及血制品的高危人群中均有較高的檢出率，在自然人群中感染TTV檢出率為12%～19%。為了解TTV在我國母嬰傳播的可能及分子病毒學(xué)依據，筆者用半巢式PCR調查我院174例產(chǎn)婦及其新生兒的TTV感染率，用克隆后序列分析測定兩對母嬰同時(shí)陽(yáng)性者TTV基因序列。結果報道如下。

　　1 資料與方法

　　1.1 研究對象

　　1998年1～12月期間住院的174例正常產(chǎn)婦，年齡21～37歲，ALT均正常。出生時(shí)同時(shí)采集母嬰配對血清，所有血清標本均于-30℃保存，集中檢測。所有產(chǎn)婦HBsAg和抗-HCV均為陰性。

　　1.2 肝炎標志物檢測

　　HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc、IgM、抗-HCV均以酶免疫法檢測。

　　1.3 DNA抽提［5］  

　　血清和蒸餾水50μl混勻稀釋后，加入100μl裂解液（25mmol/L醋酸胺，2.5mmol/L EDTA，1%SDS，2mg/ml蛋白酶K）和10μg/ml tRNA載體，68℃消化2h后，常規苯酚和氯仿法抽提。

　　1.4 PCR擴增TTV DNA ［6］  

　　用半巢式PCR，第1輪引物用NG0635’-CTGGCATTT-TACCATTTCCAAAGTT，第2輪引物用NG0615GGCAACATGTTATGGATAGACTGG和NG063。第2輪PCR反應條件:取模板3μl，10×PCR反應緩沖液3μl，d NTP各200μmol/L，NG059/NG063各15pmol，Taq DNA 聚酶1.5U，總反應體積30μl。94℃預變性180s，93℃40s，54°40s，70℃60s，擴增30 循環(huán)，70℃180s，結束反應。取第1輪PCR產(chǎn)物3μl作模板，用NG061/NG063引物進(jìn)行第2輪擴增，擴增條件同第1輪循環(huán)。取PCR產(chǎn)物10μl于2%瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色，紫外燈下觀(guān)察結果。

　　1.5 克隆序列分析

　　方法見(jiàn)文獻 ［5］  ，隨機選擇兩對母嬰TTV均陽(yáng)性第2輪PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳純化，克隆入T載體（Promega Co.）。重組克隆經(jīng)酶切鑒定后，用ABI310全自動(dòng)測序儀測序。測序引物用T7和SP6。得到的TTV序列片段（1915～2185核苷酸片段）與通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)下載的基因庫TTV日本株比較（序列號AB008394）。

　　2 結果

　　2.1 產(chǎn)婦和新生兒中TTV檢出率

　　174例產(chǎn)婦中24例用PCR擴增出預定 小270bp的條帶，說(shuō)明有24例產(chǎn)婦可檢出TTV感染，檢出率為13.8%。其中8例產(chǎn)婦與新生兒同時(shí)檢出，陽(yáng)性率為4.6%。所有TTV陽(yáng)性的產(chǎn)婦與新生兒血清ALT均在正常范圍。

　　2.2 序列測定及同源性分析

　　用克隆后測序分析兩對母嬰配對TTV片段序列（核苷酸1915～2185），并與通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)下載的基因庫TTV日本株比較（序列號AB008394），發(fā)現1號家庭母親和嬰兒感染的序列完全相同，同源性為100%，但與日本株比較均有1個(gè)核苷酸差別。2號家庭母親和嬰兒感染的序列也完全相同，但與日本株比較均有2個(gè)核苷酸差別，與1號家庭感染的毒株有1個(gè)核苷酸差別。

　　3 討論

　　TTV為單鏈環(huán)狀病毒，可能屬于環(huán)狀病毒科，它與某些動(dòng)物單鏈病毒如微小病毒B19相近似 ［1，6～8］  。該病毒的全基因組已克隆。Okamoto等 ［6］  對日本供血員及各型肝炎患者、暴露于血及血制品的高危人群血清進(jìn)行了TTV檢測。結果，非甲-庚型慢性肝病患者中檢出率為46%，重型肝炎患者為47%，肝硬化者為48%，靜脈注射毒品成癮者為40% ［6］  ，供血者檢出率為12%，明顯低于其它組患者。最先報道認為T(mén)TV經(jīng)過(guò)血液和血液制品傳播。國內駱抗先等 ［4］  通過(guò)對某校暴發(fā)流行的一次以單項轉氨酶升高為特點(diǎn)的肝炎患者做了詳盡的流行病學(xué)調查，首先證實(shí)TTV可經(jīng)過(guò)消化道傳播。不同人群中高的TTV感染率提示TTV有經(jīng)母嬰傳播的可能性。為了解TTV在我國母嬰傳播的可能，筆者用半巢式PCR調查174例產(chǎn)婦及其新生兒的TTV感染率，發(fā)現24例產(chǎn)婦用半巢式PCR可檢測出TTV，檢出率為13.8%。在日本一項研究發(fā)現21例TTV陽(yáng)性母親所生的嬰兒42.9%在出生后4個(gè)月內成為T(mén)TV陽(yáng)性［9］  。且發(fā)現母乳喂養時(shí)間長(cháng)的嬰兒，感染TTV的機會(huì )大，所有感染TTV的嬰兒均肝功能正常，該研究說(shuō)明TTV有經(jīng)母乳喂養產(chǎn)后水平傳播的可能。本研究發(fā)現24例感染的產(chǎn)婦，有8例出生嬰兒感染TTV，且出生后的靜脈血和臍血均陽(yáng)性。 一結果證實(shí)TTV母嬰傳播的可能，且在宮內已感染的可能性最大。筆者用克隆后測序分析了其中的兩對母嬰配對TTV片段序列，發(fā)現2個(gè)家庭母親和嬰兒感染序列完全相    同，同源性均為100%，但2個(gè)家庭之間序列以及與日本株 比較均有核苷酸差別。這一結果進(jìn)一步從分子水平闡明TTV母嬰傳播的可能，豐富了對TTV傳播途徑的認識。TTV與微小病毒B19同源性較高，微小病毒B19宮內感染可致胎兒水腫和流產(chǎn)。因此，有關(guān)TTV對胎兒的危害及新生兒生長(cháng)發(fā)育的影響值得進(jìn)一步研究。

 

　　參考文獻

    

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