小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗(2)

 

結果分析判定及注意事項

 

（一）一般培養性狀

本菌為革蘭氏陰性桿菌或球桿菌，普通堿性染料易于著(zhù)色，偶而可見(jiàn)兩極濃染，大小為0.8~3.0μm×0.8μm，多為單個(gè)散在，有時(shí)排列為短鏈狀或成堆，不形成芽胞，無(wú)莢膜，有周鞭毛，但不穩定，于26℃培養物中可見(jiàn)周鞭毛，30℃以上易消失，26℃培養有動(dòng)力，37℃培養無(wú)動(dòng)力，在22~26℃普通培養基上生長(cháng)的幼齡菌，球形占優(yōu)勢，37℃培養時(shí)或在陳舊培養物中趨向多形性。最適溫度為22~29℃，能在0~4℃生長(cháng)繁殖，在腸道細菌所用的培養基上都能生長(cháng)，但生長(cháng)速度比一般腸道細菌慢，如在SS瓊脂和麥康凱瓊脂培養基上24h培養后菌落極小，48h可生成圓形、光滑、濕潤、扁平、半透明的菌落，初分離的菌落多為光滑型，連續培養或保存不適，可有粗糙型出現。在去氧膽酸鈉瓊脂上，菌體個(gè)體差異顯著(zhù)，主要呈明顯大小不一，球桿、桿狀并存，有時(shí)可見(jiàn)有著(zhù)色不良的個(gè)體，在CIN瓊脂上生長(cháng)良好，菌落較大，直徑可達1.5~3.5mm，菌落中心呈紅色，周?chē)�有明顯透明環(huán)的特點(diǎn)，易于觀(guān)察區別。不同型的菌株，菌落大小有明顯不同。在肉湯等液體培養基中生長(cháng)均勻混濁，一般不形成菌膜。

圖7-1　小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗程序

 

（二）樣品采取和處理

采取的樣品以無(wú)菌操作放滅菌容器內，應立即送檢，并注意冷藏，根據樣品的種類(lèi)分別進(jìn)行處理，固體食品如肉類(lèi)及其制品等，均需用均質(zhì)器打碎或用乳缽研磨后再進(jìn)行增菌培養。

 

（三）增菌培養

為使受損傷的小腸結腸炎耶爾森氏菌得到較好的恢復和繁殖或由污染少量細菌的樣品中檢出，必須采用增菌的方法，根據該菌能在0~4℃生長(cháng)的特點(diǎn)，采用4℃冷增菌，有利于耶氏菌存活和緩慢繁殖，而對大多數其他細菌不利或保持不變，特別適用于含菌量少的被檢材料，同時(shí)改良磷酸鹽緩沖液對本菌有一定的選擇性，經(jīng)冷增菌培養后，分別在7d、14d、21d時(shí)進(jìn)行分離，可獲得較好的檢出效果，雖然增菌時(shí)間較長(cháng)，但可提高檢出率。

 

（四）堿處理

小腸結腸炎耶爾森氏菌比其他革蘭氏陰性細菌生長(cháng)慢，因其他細菌都能在弱選擇性分離瓊脂平板上生長(cháng)，尤其在22~26℃情況下仍可生長(cháng)較快，而耶爾森氏菌往往易被掩蓋。為控制其他細菌的過(guò)多生長(cháng)，采用耶爾森氏菌對弱堿性有較高低抗力的特點(diǎn)，將冷增菌后的樣液，經(jīng)弱堿液迅速處理15s，立即接種選擇性平板進(jìn)行分離，此方法可殺死大部分不耐堿的其他細菌，可提高小腸結腸炎耶爾森氏菌的檢出率。必須嚴格掌握處理方法，不宜超過(guò)時(shí)間，以免影響檢出效果。

檢驗乳品時(shí)不需要進(jìn)行堿處理，增菌培養后可直接進(jìn)行分離，尤其在細菌污染較少情況下的樣品，經(jīng)堿處理后有時(shí)對該菌的檢出也能受到影響。

 

（五）分離培養

將上述冷增菌液和堿處理后的培養物分別分離CIN-1平板和改良y培養基，經(jīng)26℃ 48h培養后觀(guān)察，挑選可疑菌落，小腸結腸炎耶爾森氏菌在CIN-I平板上生長(cháng)菌落較大，扁平，有明顯的邊緣，中心為深紅色，周?chē)�有半透明圓環(huán)的特征，成牛眼狀菌落，其他腸桿菌在此培養基上與本菌菌落形態(tài)不同，易于鑒別。在改良y瓊脂平板上生長(cháng)為無(wú)色透明、光滑、扁平、不粘稠的菌落。經(jīng)樣品分離效果比較，改良y的分離率高于麥康凱和SS培養基，因此選用了CIN-I和改良y培養基結合使用，可以達到較好的分離選擇效果。

CIN瓊脂（Cefsulondin-Irgasan-Novobiocin　Agar）是一種對耶氏菌選擇性較強的培養基，為Schienann氏于1979年研制成功的，由于配方中Irgasan成分在我國不易購到，無(wú)法應用，經(jīng)試驗后改用二苯醚代替，其選擇培養基的效果反應相同，因此稱(chēng)為“CIN-I”。

 

（六）改良克氏雙糖試驗

由上述平板上挑選可疑菌落，接種改良克氏雙糖斜面進(jìn)行初篩，26℃ 24h后斜面底層均變黃色（少數因不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵蔗糖者斜面可仍為紅色），硫化氫陰性和不產(chǎn)生氣體的培養物做進(jìn)一步生化試驗。

利用改良克氏雙糖瓊脂斜面對本菌初篩，比三糖鐵瓊脂斜面更為可靠。因為有些細菌如變形桿菌、檸檬酸桿菌、克雷伯氏菌等，都可能產(chǎn)生類(lèi)似耶氏菌的底層和斜面均產(chǎn)酸的反應，在三糖鐵瓊脂上有15％的細菌反應不一致，難以區分，但在改良克氏雙糖上的反應與其他易于混淆的細菌反應不同，絕大部分的耶氏菌在改良克氏雙糖斜面上反應一致，耶氏菌甘露醇陽(yáng)性者為100％，蔗糖陽(yáng)性者為98％，乳糖則為8％-15％，而變形菌對甘露醇，乳糖則為陰性，即可排除部分非耶氏菌的干擾。

 

（七）尿素酶和動(dòng)力試驗

在進(jìn)行進(jìn)一步篩選試驗中，尿素酶反應是一項非常重要的生化試驗，注意培養基制做時(shí)尿素不要高溫加熱，以防水解影響效果，接種細菌時(shí)菌量可適當大些，一般在2~4h培養基變紅，為尿素酶陽(yáng)性。

同時(shí)將此菌接種兩管半固體，分別放37℃和26℃，24h后觀(guān)察，小腸結腸炎耶爾森氏菌于26℃培養有動(dòng)力，在37℃培養不產(chǎn)生動(dòng)力。

 

（八）生化學(xué)性狀

小腸結腸炎耶爾森氏菌的生化學(xué)特性較為復雜，與腸桿菌科中其他細菌相比，有許多相似之處，但由于耶氏菌的各種生物型別和血清型別的生理學(xué)特性不太相同，其某些生化學(xué)性狀有時(shí)是不定的，特別是各種因素的影響，如培養條件、時(shí)間、溫度的不同，能使某些細菌生化性狀改變，有些細菌對醇類(lèi)的反應迅速，有的遲緩或不發(fā)酵。對其地理分布，菌株來(lái)源等也有著(zhù)一定關(guān)系，一般生化反應在22~30℃情況下較為穩定。

 

因此，必須掌握好試驗要求，以免影響對結果的判定。

其生化學(xué)試驗項目的選定，各個(gè)國家很不一致。本方法采用以下幾項主要生化學(xué)項目，是由于增菌和初篩試驗中，基本上排除了非耶氏菌屬的可疑細菌，簡(jiǎn)化為屬內鑒別的分型表（表7-1）。

表7-1　小腸結腸炎耶爾森氏菌與其他相似菌的生化性狀鑒別

	小腸結腸炎耶爾森氏菌	中間型耶爾森氏菌	弗氏耶爾森氏菌	克氏耶爾森氏菌	假結核耶爾森氏菌	鼠疫耶爾森氏菌
動(dòng)力(26℃)	＋	＋	＋	＋	＋	－
尿素酶	＋	＋	＋	＋	＋	－
v-p試驗(26℃)	＋	＋	＋	－	－	－
鳥(niǎo)氨酸脫羧酶	＋	＋	＋	＋	－	－
蔗糖	d	＋	＋	－	－	－
棉子糖	－	＋	－	－	－	d
山梨醇	＋	＋	＋	＋	－	－
甘露醇	＋	＋	＋	＋	＋	＋
鼠李糖	－	＋	＋	－	－	＋

 

注：＋陽(yáng)性；－陰性；d有不同生化型。

 

（九）血清學(xué)

小腸結腸炎耶爾森氏菌的抗原結構較為復雜，目前尚未研究清楚，其血清型主要靠菌體抗原即O抗原，至1984年Wauter等增加為57個(gè)型，現已知有84個(gè)O抗原因子和19個(gè)Ｈ抗原因子，在同一血清型的菌株中，可含兩種或更多的O抗原，用病人分離的小腸結腸炎耶爾森氏菌，其血清型大部分為O：3，O：5，O：8和O：9型，某些O抗原同其他細菌有共同性，如O：9與布氏菌有交叉反應，O：12血清與沙門(mén)氏菌有交叉反應等，在流行病學(xué)調查中，血清學(xué)診斷起著(zhù)較為重要的作用，但在區分致病性與非致病性上價(jià)值不大。

 

進(jìn)行血清學(xué)試驗時(shí)，可將被檢菌接種于普通斜面上，于26℃培養48h，取其培養物用分型血清做玻片凝集試驗，注意同時(shí)與生理鹽水作對照，在三糖鐵斜面上于37℃培養的細菌常為粗糙型（R型），容易產(chǎn)生自凝。