致病性大腸埃希氏菌及其檢驗（3）

五、檢驗

致病性大腸埃希氏菌的檢驗應按《中華人民共和國國家標準——食品衛生檢驗方法(微生物學(xué)部分)》(GB489．6-84)的有關(guān)內容進(jìn)行檢驗。

（一）、增菌培養

1、以無(wú)菌操作的方法稱(chēng)取樣品25g，加入225ml營(yíng)養肉湯培養基中，可用滅菌砂在研缽中磨碎或以均質(zhì)器打碎樣品。

2、取適量接種于乳糖膽鹽培養基中，測定大腸菌群MPN，其余移入500ml三角瓶中于36±1℃培養6小時(shí)。挑取一環(huán)，接種于一管30ml腸道菌增菌湯中，42℃增菌培養18小時(shí)。

（二）、分離培養

1、將乳糖膽鹽發(fā)酵陽(yáng)性管液與增菌液分別劃線(xiàn)接種于麥康凱或伊紅美蘭瓊脂平板上。

2、于36±1℃培養18—24小時(shí)觀(guān)察菌落

對于污染嚴重的食品可直接按劃線(xiàn)法接種，不經(jīng)過(guò)增菌過(guò)程。

（三）、生化試驗

1、初篩試驗

選取在麥康凱或伊紅美蘭平板上發(fā)酵乳糖或不發(fā)酵乳糖的菌落5個(gè)以上，分別接種于克氏雙糖鐵、pH7.2尿素和阿拉伯糖中．經(jīng)36C培養18～24小時(shí)，棄去H2S陽(yáng)性或尿素酶陽(yáng)性或阿拉伯糖陰性的培養物。

2、復篩試驗

把篩留下的培養物分別接種于緩沖葡萄糖蛋白胨和KCN培養基中，經(jīng)36+1℃培養48小時(shí)，觀(guān)察生長(cháng)結果并做V-P試驗，棄去V-P陽(yáng)性及KCN陽(yáng)性的培養物。

3、證實(shí)試驗

致病性大腸埃希氏菌屬除氧化酶陰性，革蘭氏陰性的特征以外，還有以下特性：葡萄糖產(chǎn)酸+，葡萄糖產(chǎn)氣+／一，乳糖產(chǎn)酸+90％，檸檬酸鹽—，尿素酶一，KCN-，V-P-，動(dòng)力+或—，阿拉伯糖十，靛基質(zhì)十95％：可按這些主化特性進(jìn)一步證實(shí)其是否為致病性大腸埃希氏菌屬。

（四）血清學(xué)試驗

1、致病性大腸埃希氏菌血清學(xué)試驗

假定試驗：

從平板上選菌落生長(cháng)稠密處挑取培養物，用致病性大腸埃希氏菌三種OK多價(jià)血清做玻片凝集試驗。不凝集的培養物可做陰性報告。

證實(shí)試驗：

2、侵襲性大腸埃希氏菌血清學(xué)試驗

在平板上菌落生長(cháng)稠密處挑取培養物，用侵襲性大腸埃希氏菌診斷血清做玻片凝集試驗，侵襲性大腸埃希氏菌診斷血清包括兩種：OK多價(jià)血清和9種OK單價(jià)血清：

（五）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌毒素試驗

1、動(dòng)物試驗

將經(jīng)過(guò)生化證實(shí)試驗的大腸埃希氏菌培養物接種肉湯管，于36+1℃培養24小時(shí)，3000轉／分離心30分鐘。取上清液用G6濾器過(guò)濾后分作兩份，一份加熱60℃30分鐘，供ST測定用，另一份不加熱，供LT測定用。

1）家免結軋回腸段試驗：

取體重為2kg的家兔，禁食使腸內容物排空。麻醉后剖腹，取出回腸段，按10～15cm為一段，分段結扎，取一段注射肉湯2mL作為陰性對照，另一段注射已知產(chǎn)毒菌肉湯培養物的上清液2ml作為陽(yáng)性對照。其他各段分別注射待試菌株肉湯培養物的濾液2mL。將腹壁縫合。

測定LT時(shí)，于注射后18小時(shí)剖腹檢查

測定ST時(shí)，于注射后6—8小時(shí)剖腹檢查

取出腸管分別抽取腸段的積液，測定其容量，并測定腸段的長(cháng)度。積液量(mL)與腸段長(cháng)度(cm)之比大于l者為陽(yáng)性。

2）乳鼠灌胃試驗：

2、雙向瓊脂擴散試驗

將被檢菌按5點(diǎn)環(huán)形接種于Elek氏培養基上，以同樣操作共做兩份，36±1℃培養48小時(shí)，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素紙片，36+1℃經(jīng)5—6時(shí)，使抗生素滲入瓊脂中，在五點(diǎn)環(huán)形菌苔各5mm處的中央，挖一個(gè)直徑4mm的園并用一滴瓊脂墊底。在一份平板的孔內滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔內滴加ST毒素30ul。放于36+1℃經(jīng)15～20小時(shí)觀(guān)察結果，在菌斑和抗毒素之間出現白色沉淀帶為陽(yáng)性，無(wú)沉淀帶者為陰性。

（六）豚鼠角膜試驗

供測定侵襲性大腸埃希氏菌用，將經(jīng)過(guò)生化證實(shí)試驗的待試菌株18—20小時(shí)瓊脂培養物，用肉湯洗下，使成每lml含菌9億個(gè)菌懸液，作為接種材料。

體重400--500g的健康豚鼠(角膜與結膜外觀(guān)正常，并經(jīng)細菌培養檢查)的角膜上接種待試菌懸液1滴。

48小時(shí)后觀(guān)察結果，結膜充血浮腫、角膜混濁、眼內充盈淚液或漿液性分物者為陽(yáng)性，自結膜囊取樣分離細菌，鑒定應與原接種菌一致。

（七）、結果報告

根據以上生化試驗、血清學(xué)試驗、腸毒素試驗和豚鼠角膜試驗的結果出報告，如果是產(chǎn)毒大腸埃希氏菌時(shí)應有腸毒素試驗的結果；如果是侵襲性大腸埃希氏蔭應有豚鼠角膜試驗和血清學(xué)試驗的結果；如果是腸致病性大腸埃希氏菌時(shí)應有血清學(xué)試驗結果。

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