微生物室常用的病原真菌檢查方法

1、真菌鏡檢

是最簡(jiǎn)單也是很有價(jià)值的實(shí)驗室診斷方法。其優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)便、快速，無(wú)菌部位的陽(yáng)性結果可直接確定真菌感染。但是由于陽(yáng)性率較低，陰性結果亦不能排除診斷。直接鏡檢對于淺表和皮下真菌感染最有幫助。在皮膚刮屑、毛發(fā)或甲標本中發(fā)現皮膚癬菌、念珠菌和馬拉色菌的成分可提供對相應真菌病的可靠診斷。如在無(wú)菌體液的 直接鏡檢中發(fā)現真菌成分�？纱_立深部真菌病的診斷，例如在腦脊液中檢測到帶莢膜的新生隱球菌酵母細胞，或外周血涂片中檢測到莢膜組織胞漿菌細胞。但一般在有菌部位則只有發(fā)現大量真菌菌絲方才有意義，通過(guò)直接鏡檢一般可以區分念珠菌、隱球菌、暗色真菌、毛霉（接合菌）等菌的感染，進(jìn)一步明確鑒定菌種需要通過(guò) 培養鑒定來(lái)完成。

2、真菌培養

真菌培養是實(shí)驗室檢查中的重要環(huán)節，培養出致病真菌是進(jìn)一步鑒定菌種的前提條件。真菌培養第一步是從臨床標本中培養真菌的初代培養，初代培養后進(jìn)一步進(jìn)行分離純化培養和鑒定培養。不同致病真菌每一步所采用的培養基，培養時(shí)間和培養溫度存在一定的差異。常規的真菌培養需要在28-30°C溫度下培養3-4 周，一般初代培養選用沙氏培養基（SDA）或者馬鈴薯瓊脂培養基（PDA），采用試管培養，一般同時(shí)培養兩管，其中一管可添加抗生素（氯霉素或慶大霉素均 可）。在培養1周內，應該每天觀(guān)察有無(wú)真菌生長(cháng)。一般培養4周后，如果無(wú)真菌生長(cháng)可報陰性。發(fā)現培養出真菌，直接挑取少量菌體或者小培養后，用乳酸酚棉蘭制成涂片顯微鏡下觀(guān)察，結合菌落大體形態(tài)，典型菌種可直接報告種屬。不典型菌種根據基本表現，采用適當的標準鑒定培養基，標準培養條件培養，必要時(shí)要結合 生理學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。

    3、真菌鑒定

    對常見(jiàn)致病真菌要掌握的鑒定原則是首先區分酵母菌和霉菌。

    如果初代培養基上培養出酵母樣菌落，在鑒定前應進(jìn)行分離純化。在去除細菌和其他真菌污染，區分混合感染后，對純菌落進(jìn)行鑒定。酵母菌鑒定主要根據形態(tài)學(xué)特征和生理生化特點(diǎn)，按照一定的流程進(jìn)行。首先根據菌落顏色進(jìn)行分類(lèi)。臨床最為常見(jiàn)的是白色或奶白色菌落，這類(lèi)菌進(jìn)一步做芽管試驗，若芽管試驗是陽(yáng)性則為白 念珠菌，若陰性則通過(guò)Vitek YBC或API20C及玉米吐溫瓊脂上培養的形態(tài)特征來(lái)鑒定。另外，還可以應用念珠菌顯色瓊脂、尿素酶試驗等試驗來(lái)輔助鑒定。

    霉菌的鑒定非常復雜，有許多標準包括形態(tài)學(xué)特征、溫度耐受性，放線(xiàn)菌酮抗性、雙相性、營(yíng)養需求、蛋白分解活動(dòng)以及水解尿素能力等�，F代分類(lèi)學(xué)鑒定方法主要依據分生孢子的個(gè)體發(fā)生過(guò)程結合其他特征來(lái)進(jìn)行鑒定。初代培養后根據形態(tài)學(xué)特征一般可鑒定到屬的水平，再依據不同真菌的鑒定要求，采用標準培養基和培養條 件進(jìn)一步完成菌種鑒定。例如：曲霉屬鑒定時(shí)需要采用標準培養基，即察氏培養基和麥芽瓊脂，25℃培養7天后與曲霉形態(tài)鑒定檢索表對應得到正確的結果。

    （一）形態(tài)學(xué)鑒定

    1、菌落形態(tài)觀(guān)察  致病真菌的形態(tài)學(xué)鑒定的第一步就是要區別不同的菌落特征。即酵母型菌落或絲狀型（霉菌）菌落。對霉菌通常采用形態(tài)學(xué)鑒定為主, 而酵母菌常需采用形態(tài)和生理相結合的手段。觀(guān)察真菌菌落時(shí)應注意菌落大小、形態(tài)、色素、顏色和質(zhì)地。

    2、顯微鏡檢查  為充分在鏡下觀(guān)察真菌結構，必須用分離針挑出一部分菌落進(jìn)行觀(guān)察。常用乳酸酚苯胺藍(LPCB，棉藍)對挑取的部分菌落進(jìn)行染色。此項操作必須在生物安全柜中進(jìn)行。樣本需要保存時(shí)可用指甲油封邊。小培養、覆蓋培養、透明膠帶法等均是常用的方法。

    3、玻片培養  是一種特殊的玻片作成的培養小室，可以更為清楚地觀(guān)察真菌孢子和分生孢子的形成及位置。涉及小培養的所有操作均應在生物安全柜中進(jìn)行�？蛇x用馬鈴薯瓊脂、玉米瓊脂或V-8果汁做培養基。

    4、透明膠帶法  用透明膠帶粘取菌落表面置于鏡下觀(guān)察，是一種不破壞分生孢子結構的快捷方法。

    5、電鏡觀(guān)察  透射電鏡(TEM)用來(lái)觀(guān)察真菌的斷面，橫隔的差別、各種細胞器、細胞壁等結構。掃描電鏡（SEM）用來(lái)觀(guān)察真菌的表面結構，特別是產(chǎn)孢特點(diǎn)。

 

    用表型特征對真菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定，仍然是目前臨床實(shí)驗室普遍應用的方法。對致病真菌的鑒定，需要選擇合適的培養基進(jìn)行培養后，再借助光學(xué)顯微鏡，加上熒光顯微鏡、電子顯微鏡和細胞化學(xué)等各種染色法觀(guān)察形態(tài)特點(diǎn)。

    （二）分子生物學(xué)鑒定

    應用分子生物學(xué)技術(shù)從遺傳和進(jìn)化角度闡明真菌菌種之間和種間內在關(guān)系是目前真菌分類(lèi)研究熱點(diǎn)，已普遍應用于真菌現代分類(lèi)鑒定之中。

    常用的分子生物學(xué)鑒定方法包括：真菌DNA 鹼基組成（G+C Mol%）、限制性片段長(cháng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）、Southern 印跡、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）、rDNA序列測定等。由于生物多樣性的緣故，分子生物學(xué)的研究有4種目的：①系統發(fā)生研究；②分類(lèi)學(xué)研究，主要在屬、種水平；③鑒定應用，即決定明確的分類(lèi)名稱(chēng)；④流行病學(xué)和群體的遺傳學(xué)研究。

DNA序列測定是目前最引人注目的發(fā)展方向，已成為致病真菌的分類(lèi)鑒別的重要手段。目前應用最多的為rDNA序列、幾丁質(zhì)合成酶、細胞色素P450 L1A1基因，細胞色素氧化酶C和細胞色素B等基因序列。 

    （三）生理學(xué)和生物化學(xué)方法  在純培養上真菌生長(cháng)比較快，可以使用生理、生化方法來(lái)鑒定菌種，多用于酵母菌的鑒定。測定真菌的不同生長(cháng)溫度的溫度試驗也用于鑒定。對碳水化合物的利用能力是酵母菌鑒定的主要手段，目前已有商品化的API系統，也可用于絲狀真菌的輔助鑒定。

 

    此外，微生物自動(dòng)鑒定系統Vitek、autoSCAN-4、Biolog和MIS等自動(dòng)鑒定系統，可以較滿(mǎn)意地鑒定臨床上常見(jiàn)的病原性酵母菌。   

    雖然經(jīng)典檢查方法是真菌檢查的基礎，雖然操作簡(jiǎn)便但存在著(zhù)敏感度低，耗時(shí)長(cháng)等不足。近年來(lái)，除經(jīng)典的真菌學(xué)方法以外的非培養檢查方法在真菌感染診斷，特別是侵襲性真菌病方面發(fā)揮了重要作用。這些方法主要包括血清學(xué)檢查、和分子生物學(xué)檢查等。     1、血清學(xué)方法檢測真菌抗原成分

    念珠菌感染和曲霉感染的血清學(xué)檢測可分為抗體檢測和抗原檢測兩大類(lèi)；由于發(fā)生侵襲性真菌病的免疫受損宿主往往缺乏可檢測到的抗體，或者抗體的產(chǎn)生變化較大，因此檢測抗體對于系統性真菌感染的診斷意義不大，而目前用于臨床的血清學(xué)檢查主要屬于后者，即檢測血液循環(huán)中的抗原；常用的有下述幾種：

    （1）、β-D-1,3葡聚糖（BDG）：是許多真菌細胞壁的主要成份，如念珠菌、曲霉、鐮刀菌等，但不包括隱球菌和接合菌；由于細菌、病毒、哺乳動(dòng)物無(wú)這種成份，因而在循環(huán)血液中測得時(shí)則提示侵襲性真菌感染，目前已經(jīng)有商品化BDG檢測的試劑盒。BDG的檢測，在2小時(shí)內可以獲得結果，因此盡管不能區分 真菌感染的種類(lèi)，但是仍然具有重要作用，美國FDA已經(jīng)批準Fungitell用于真菌感染的診斷，國內也有相似試劑問(wèn)世，目前在臨床應用中。

    （2）、半乳甘露聚糖（GM）：GM是存在于曲霉和青霉細胞壁的一種熱穩定的多糖，可用于侵襲性曲霉病的臨床診斷�？梢允褂醚�清和支氣管肺泡灌洗液檢測 GM，近來(lái)也有人使用尿液和腦脊液等標本檢測。GM檢測的敏感性為29-100%，而其特異性可超過(guò)90%。由于GM量的多少與組織中真菌含量密切相關(guān)， 因此檢測GM還可以提示疾病的預后。

    2、分子生物學(xué)檢測：

    由于真菌培養和鑒定需要的時(shí)間較長(cháng)，陽(yáng)性率較低，因此與分子生物學(xué)相關(guān)的從臨床標本直接檢測真菌的技術(shù)和方法也在不斷發(fā)展中，最為活躍的當屬PCR技術(shù)， 具有快速、敏感等特點(diǎn)。PCR技術(shù)可以擴增血清、血漿、全血、尿液、痰液、支氣管肺泡灌洗液和膿液等標本中的真菌成份。在進(jìn)行擴增之前，應當對標本進(jìn)行處理以去除影響擴增效率的一些因子。所擴增的靶序列有多種，但是應用較多的還是 rDNA的ITS1和ITS2區域；與培養相比，ITS-PCR檢測血標本中念珠菌的敏感性與特異性可以達到100%。在PCR擴增檢測中，有傳統的 PCR方法，也有巢式PCR法，最近應用較多的是實(shí)時(shí)定量PCR方法，其敏感性和特異性較好，在臨床有應用前景