沙門(mén)菌屬和志賀菌屬檢驗

　　1．掌握沙門(mén)菌屬和志賀菌屬細菌的形態(tài)及染色特性、生化反應、培養方法及鑒定意義。

　　2．掌握沙門(mén)菌屬和志賀菌屬細菌的血清學(xué)鑒定方法。

　　3．掌握肥達試驗的原理、操作方法及結果判斷。

 

　　1．菌種 福氏、宋內志賀菌、傷寒沙門(mén)菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌。

　　2．培養基 SS平板、中國藍、EMB、MAC、KIA、MIU、硝酸鹽培養基。

　　3．試劑 氧化酶試劑或氧化酶紙片、3％過(guò)氧化氫溶液、柯氏試劑、甲基紅試劑、400g/L KOH、志賀菌診斷血清(包括志賀菌屬四種多價(jià)血清及福氏、宋內志賀菌單價(jià)血清)、沙門(mén)菌A～F菌體(O)多價(jià)和O及H因子血清；傷寒沙門(mén)菌O、H診斷菌液、乙型副傷寒沙門(mén)菌H診斷菌液、傷寒或副傷寒患者血清或模擬標本，免疫血清。

　　4．其他清潔載玻片、革蘭染色液、生理鹽水等、試管、40孔試管架、lml吸管、5ml吸管、無(wú)菌滴管、洗耳球、37℃或45℃水浴箱等。

 

　　1．形態(tài)觀(guān)察

　　　(1)革蘭染色：沙門(mén)菌屬細菌為革蘭陰性細長(cháng)桿菌。志賀菌屬細菌為革蘭陰性桿菌，散在分布。

　　　(2)觀(guān)察鞭毛染色標本片：鏡下可見(jiàn)沙門(mén)菌屬細菌具有周鞭毛。志賀菌屬細菌無(wú)鞭毛。

 

　　2．菌落觀(guān)察

　　　(1)沙門(mén)菌屬：將本菌接種在SS、MAC平板上經(jīng)35℃孵育18～24h。由于本菌不分解乳糖并產(chǎn)堿，故在SS和MAC平板上形成無(wú)色、半透明、光滑濕潤、凸起的小菌落，產(chǎn)生H2S的菌落可在SS平板上形成中心帶黑褐色的小菌落。

　　　(2)志賀菌屬：將本菌接種在SS和MAC平板上經(jīng)35℃孵育18～24h。由于志賀菌不分解乳糖，宋內志賀菌某些菌株可遲緩發(fā)酵乳糖，故其在SS平板和MAC平板上形成無(wú)色透明的、中等大小的菌落。除宋內志賀菌菌落外均為光滑型菌落。

 

　　3．生化反應

氧化酶試驗：方法同大腸埃希菌。沙門(mén)菌屬和志賀菌屬細菌氧化酶試驗均為陰性。初步試驗鑒定：挑取志賀菌和沙門(mén)菌的單個(gè)菌落分別接種在KIA、MIU和硝酸鹽培養基上，經(jīng)35℃孵育18～24h，同時(shí)做觸酶試驗。其結果見(jiàn)表2—4。

表2-4 志賀菌屬和沙門(mén)菌屬的基本生化反應

	KIA				MIU			氧化酶	觸酶	硝酸鹽還原
	斜面	底層	產(chǎn)氣	H2S	動(dòng)力	吲哚	脲酶
志賀菌	K	A	-/+	-	-	+/-	-	-	+	+
傷寒沙門(mén)菌	K	A	-	+/-	+	-	-	-	+	+
乙型副傷寒菌	K	A	+	+	+	-	-	-	+	+

 

最終鑒定：須做全面生化反應和血清學(xué)試驗。

 

　　 4．血清學(xué)試驗

　　　(1)志賀菌屬的分型鑒定：凡生化反應符合志賀菌屬者均需做血清學(xué)鑒定。取1環(huán)志賀菌四種多價(jià)血清于載玻片一端，再取少許待測菌與之混合，同時(shí)在玻片另一端取待測菌與生理鹽水混合對照。結果：對照呈均勻混濁，待檢菌與志賀菌四種多價(jià)血清混合后，數分鐘內出現肉眼可見(jiàn)的顆粒狀凝集物即為陽(yáng)性。繼之用A、B、C、D群最常見(jiàn)的單價(jià)血清凝集定種。

 

　　　結果判斷、解釋和報告：

　　　�、俜蛛x培養未見(jiàn)可疑菌落或經(jīng)鑒定不符合志賀菌屬鑒定依據者可報告“未分離到志賀菌屬細菌”。

　　　�、诮�(jīng)分離鑒定后符合鑒定依據者，可報告“分離出××志賀菌”，若進(jìn)一步做多種生化反應及因子血清分型后，可報告：“分離出××志賀菌×型”。

 

　　　(2)沙門(mén)菌屬的分型鑒定：如果生化反應及形態(tài)學(xué)檢查疑為沙門(mén)菌，可選用沙門(mén)菌的多價(jià)診斷血清進(jìn)行玻片凝集。首先選用A～F組多價(jià)“O”診斷血清做玻片凝集試驗。在試驗時(shí)應以生理鹽水作對照。血清凝集試驗在5～10min內不出現凝集者可確定為陰性。但若生化反應比較典型，應考慮選用Vi凝集試驗。若凝集，則用無(wú)菌生理鹽水將菌洗下，制成濃厚的懸液，加熱100℃、30min，再與A～F組多價(jià)“O”診斷血清做凝集試驗。若與A～F組多價(jià)“O”血清發(fā)生凝集，應再與沙門(mén)菌單價(jià)因子血清分別做玻片凝集試驗，以確定該菌株屬于哪一組。一般先選用本地區檢出率最高菌型的相應血清做玻片凝集反應。

　　　若已確定哪一沙門(mén)菌種后，再分別先用H因子血清檢查第I相抗原，然后檢查第Ⅱ相抗原，最后確定該菌種屬于哪一型沙門(mén)菌。

 

　　　結果判斷、解釋和報告：

　　　�、俜蛛x培養未發(fā)現可疑菌落或經(jīng)鑒定不符合沙門(mén)菌屬細菌鑒定依據者，可報告“未分離出沙門(mén)菌”。

　　　�、谏�化反應符合沙門(mén)菌、玻片凝集試驗結果陽(yáng)性，可初步報告為：“分離到××沙門(mén)菌”，或“×群沙門(mén)菌”。

 

　　5．肥達試驗

　　　(1)原理：用已知的傷寒沙門(mén)菌O、H抗原，甲、乙型副傷寒沙門(mén)菌的H抗原(PA、PB)與腸熱癥患者血清做定量試管凝集試驗，以出現“2+”凝集的最高血清稀釋度為效價(jià)，測定相應抗體含量，用以輔助診斷腸熱癥。

　　　(2)試驗方法：為單管稀釋法。準備4排小試管，每排7支并標記，另取中號試管1支，加生理鹽水3．8ml及被檢血清O．2ml，混勻，即為1：20稀釋?zhuān)�總量�?ml。然后取出2ml按每管0.5m1分別放人各排小試管中的第1支試管中。再于上述中號試管內加生理鹽水2ml混勻，此種血清即為1：40稀釋?zhuān)�吸取此稀釋度血�?ml，按每管0.5m1分別加到各排小試管中的第2支試管中。以此類(lèi)推連續稀釋到各排小試管第6支試管為止，第7支小試管只加入0.5ml生理鹽水做陰性對照。然后按表2-5操作。

表2-5血清學(xué)試驗(肥達試驗)方法

	試驗管(每管0.5ml稀釋血清)						對照管
	1：20	1：40	1：80	1：160	1：320	1：640	生理鹽水
O抗原	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
H抗原	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
PA抗原	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
PB抗原	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
血清最終稀釋	1：40	1：80	1：160	1：320	1：640	1：1280	-

　　

　　　振蕩片刻，置于45℃水浴箱中2h或37℃水浴箱4h，取出置室溫或放冰箱中過(guò)夜，次日觀(guān)察并記錄結果。

 

　　　(3)結果判斷解釋和報告：先觀(guān)察對照管，正確結果應無(wú)凝集反應，再分別與對照管比較觀(guān)察各試管凝集情況。根據液體透明度和凝集塊多少，以4+、3+、2+、+、-符號記錄。

　　　4+：上清液完全澄清，細菌凝集塊全部沉于管底。

　　　3+：上清液澄清度達75％，大部分細菌凝集成塊沉于管底。

　　　2+：上清液澄清度達50％，約50％細菌凝集成塊沉于管底。

　　　+：上清液體混濁，管底僅有少部分細菌凝集成塊，上清液澄清度僅有25 ％。

　　　-：液體均勻}昆濁，無(wú)凝集塊。

 

　　　以呈現2+凝集現象的血清最高稀釋倍數作為該血清的凝集效價(jià)。一般認為，傷寒沙門(mén)菌O抗體凝集價(jià)在1：80以上，H抗體在1：160以上，甲、乙、丙型副傷寒沙門(mén)菌凝集價(jià)在1：80以上才有診斷意義。

 

　　1．加入診斷菌液時(shí)，由對照管開(kāi)始往前，每管各加O．5ml。

　　2. 結果觀(guān)察時(shí)不要振蕩試管，先觀(guān)察，必要時(shí)再輕搖試管使凝塊從管底升起，最后按液體的清濁，凝塊的大小進(jìn)行記錄，對照管(不凝集)與試驗管同時(shí)對著(zhù)光線(xiàn)往暗處看液體透明度和凝集塊。

　　3.“H”凝集呈絮狀，以疏松之大團鋪于管底，輕搖試管即能蕩起，而且極易散開(kāi)。

　　4．“O”凝集呈顆粒狀，以堅實(shí)凝片沉于管底，輕搖試管不易蕩起，且不易散開(kāi)。