水產(chǎn)品和畜、禽肉中氯霉素殘留量檢驗方法——氣相色譜法

氣相色譜法-質(zhì)譜檢測法

1  方法提要

根據方法進(jìn)行驗證修改后,并依據歐盟指令建立了質(zhì)譜測定條件，將某些關(guān)鍵步驟進(jìn)行細化。

本方法適用于水產(chǎn)品和畜、禽肉組織、腸衣中氯霉素殘留確證檢測。用乙酸乙酯提取，提取液用正己烷凈化，硅烷化后用氣相色譜配有負化學(xué)源的5973N質(zhì)譜檢測器檢測。

 2  實(shí)驗室設備

2.1  儀器和設備

2.1.1 Agilent6890氣相色譜儀：配有負化學(xué)源的5973N質(zhì)譜檢測器。

2.1.2 離心機：5810型，Eppendorf公司。

2.1.3 均質(zhì)器：T25型，18G 刀，IKA公司

2.1.4 旋轉蒸發(fā)器：R-200，BUCHI公司。

2.1.5 移液槍?zhuān)?00μL、1000μL、5000μL，Eppendorf公司。

2.1.6 具塞塑料離心管：15 mL 、50 ML。

2.1.7 渦流混勻器：39760型，Thermolyne公司。

2.2  試劑

所有試劑均為分析純級（有機試劑需重蒸餾），水為去離子水。

2.2.1  乙酸乙酯。

2.2.2  甲醇。

2.2.3  正己烷。

2.2.4  氯化鈉。

2.2.5  無(wú)水硫酸鈉：經(jīng)650℃灼燒4 h，置于干燥器內備用。

2.2.6  硅烷化試劑： Sylon BFT {99% N,O-雙（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（BSTFA）+1%三甲基氯硅烷（TMCS）{美國 Supelco產(chǎn)品，貨號33154-u，0.1mL/ampul}。

2.3  標準物質(zhì)

2.3.1  氯霉素（chloramphenicol）：純度≥99%，Amresco分裝，上海生工生物工程有限公司和Sigma公司。

2.4  標準溶液的配制

2.4.1  標準儲備液的配制

準確稱(chēng)取氯霉素標樣50mg置50ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，混勻，濃度為1 mg/mL，4℃保存6個(gè)月。

2.4.2  標準工作溶液配制：

取1mL儲備液用甲醇溶解定容到100Ml，此時(shí)濃度為1μg/mL，取1μg/mL 1mL定容至10mL，濃度為0.1μg/mL；取1μg/mL 0.5 mL定容至10mL，濃度為0.05μg/mL。

3  實(shí)驗方法

3.1  試樣制備

從所取原始樣品中取出部分有代表性樣品，經(jīng)充分混勻。用四分法縮分出不少于500 g試樣，混勻，均分成兩份。裝入清潔容器內，加封后，表明標記。

3.2  測定步驟

3.2.1  提取與凈化

稱(chēng)取5 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中。加入25 mL乙酸乙酯，用均質(zhì)器均質(zhì)提取2 min，4000 r/min離心3 min。將乙酸乙酯層移入50 mL雞心瓶中，試樣再加入5 mL乙酸乙酯，渦流混勻器混勻1min，合并乙酸乙酯提取液，于40℃旋轉蒸發(fā)至近干。

加入1 mL甲醇溶解殘渣，再加入20 mL 4% 氯化鈉溶液和15 mL正己烷，用渦流混勻器混合1 min，4000 r/min離心3 min。棄去正己烷層，水層加15 mL正己烷，同上操作，棄去正己烷層。水層中加入15 mL乙酸乙酯，用渦流混勻器混合2 min，3000 r/min離心3min。吸取乙酸乙酯層，通過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱（5g）脫水于另一個(gè)50 mL雞心瓶中，用少量乙酸乙酯淋洗無(wú)水硫酸鈉柱。于40 ℃旋轉蒸發(fā)至約1 mL。

3.2.2  衍生化

將濃縮液移入5 mL離心管中，用1 mL乙酸乙酯洗滌雞心瓶，合并乙酸乙酯。于40℃吹氮氣蒸發(fā)至干。加入100 µL正己烷和100 µL硅烷化試劑，于70℃烘箱中加熱30min。吹氮氣蒸發(fā)至干，加入0.50 mL正己烷與環(huán)己烷混合液（6：4），混勻溶解，供氣相色譜測定。

3.2.3  測定

3.2.3.1  氣相色譜條件

a) 色譜柱：30 m × 0.25 mm × 0.25 µm，HP-5MS； 

c) PTV進(jìn)樣口溫度：70℃(1.0 min)700℃/min  250℃(6.0 min) 700℃/min  300℃；

d) 載氣：氦氣，恒壓模式，柱頭壓 10psi；

e) 進(jìn)樣量：2uL

3.2.3.2  質(zhì)譜條件

a) 傳輸線(xiàn)溫度：280°C

b) 溶劑延遲：  5min

c) 離子源溫度：150°C

d) 四極桿溫度：100°C

e) 反應氣：甲烷，流量：2ml/min

f) 選擇離子監測  

目標物               監測離子

氯霉素           466，468，470，376

其中定量離子為466，定性離子為468，470，376

g) 離子停留時(shí)間：60毫秒

 

3.2.3.3  標準溶液的衍生化

取適量標準溶液，用氮氣吹干，加入200 µL正己烷和100 µL硅烷化試劑，于80℃烘箱中加熱30min。吹氮氣蒸發(fā)至干，加入0.50 mL正己烷與環(huán)己烷混合液（6:4），混勻溶解，供氣相色譜-質(zhì)譜測定。在上述色譜條件下：氯霉素保留時(shí)間為 11.65 min。

3.2.3.4  樣品測定

分別注射等體積的標準工作液、試劑空白、陰性控制樣品、待檢樣品（不超過(guò)10個(gè)）、陰性控制和陽(yáng)性控制樣品，按上述色譜條件測定，峰面積定量。  

4、氣相色譜-質(zhì)譜定性

(1)保留時(shí)間定性：在上述條件下,目標化合物的保留時(shí)間為11.65±0.1min

 (2)質(zhì)譜確證

在保留時(shí)間窗口內出現色譜峰后，獲取其質(zhì)譜圖，扣除本底后如果以下判別標準全部符合，則可判定氯霉素存在：

所有4個(gè)監測離子全部在質(zhì)譜圖中出現

離子466為基峰和定量離子，其它3個(gè)離子與基峰豐度之比應符合如下標準

質(zhì)荷比 標準豐度比（%）   允許相對偏離范圍（%）   

468 76  ±20  

470 18  ±30  

376 20  ±25  

5、質(zhì)量控制

每組實(shí)驗除標準、樣品，需同時(shí)進(jìn)行溶劑空白實(shí)驗、陰性控制樣品實(shí)驗和陽(yáng)性控制樣品實(shí)驗。

5.1 溶劑空白

不加試樣，用與樣品相同的方法進(jìn)行處理。

5.2 陰性控制樣品

稱(chēng)取5.0克陰性控制樣品，置于50 mL離心管中，用與樣品相同的方法進(jìn)行處理。

5.3 陽(yáng)性控制樣品

稱(chēng)取5.0克陰性控制樣品，置于50 mL離心管中，用微量注射器加入0.1µg/mL的氯霉素標準工作液25 µL，相當于樣品濃度0.5ng/g用與樣品相同的方法進(jìn)行處理。用相同濃度的標準進(jìn)行定量，計算回收率，用來(lái)判斷本組操作的可靠性。

6  結果計算

6.1 外標法定量

 用色譜數據處理機或按下列公式計算：

                  

式中：X—— 試樣中氯霉素藥物殘留含量，mg/kg；

A—— 樣液中硅烷化氯霉素色譜峰面積；

AS——標準工作溶液中硅烷化氯霉素色譜峰面積；

  c—— 標準工作溶液中氯霉素的濃度，µg/mL；   

V—— 最終樣液的定容體積，mL；

   m—— 最終樣液所代表試樣量，g。

計算結果需扣除空白值。

 

7 測定低限

本方法氯霉素的測定低限為 0.2 µg/kg.

8 可接受的檢驗結果

在添加濃度0.5μg/kg時(shí)，回收率，50%~120%。

9 檢測報告

按照SPSBA00024檢驗報告管理程序執行。

10 方法驗證

10.1 取相當于1μg/g的氯霉素衍生化物，在200-600M/z范圍，進(jìn)行全掃描分析，確定定量離了和確證離子及其豐度比，見(jiàn)附錄1。

 

10.2 標準工作曲線(xiàn)

用注射器分別移取0.05µg/mL ，20µL 、30µL、60µL；0.1µg/mL，50µL, 1µg/mL, 25µL、標準工作液置于6個(gè)5ML 離心管中，氮氣吹干，其系列分別相當于樣品中0.2、0.3、0.4、1、5 ng/g的濃度。

分別注射等體積的標準工作液按給定的色譜條件進(jìn)行測定，用GC-NCI-MS測定。記錄峰面積，以峰面積為縱坐標，目標化合物濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線(xiàn)，計算線(xiàn)性關(guān)系，得到相關(guān)系數，結果見(jiàn)附錄2。

10.3  回收率實(shí)驗和室內精密度實(shí)驗

以陰性控制樣品為測試樣品，添加水平分別為0.2μg/kg，0.3μg/kg， 0.4μg/kg，做6個(gè)平行樣，共做三次，用對應工作曲線(xiàn)計算每個(gè)樣品的濃度，并計算回收率、標準偏差和變異系數。