SN 0184-93 出口食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢驗方法
Method for the examination of Listeria monocytogenes in food for export
樣品：冷凍樣品，2－5℃解凍，不超過(guò)18h
若不能及時(shí)檢驗，應置于－15 ℃保存。
非冷凍易腐樣品應盡可能及時(shí)檢驗。
若不能及時(shí)檢驗，應置于4 ℃冰箱保存，在24h之內檢驗。
兩次增菌：
巴氏消毒乳、乳制品、冷凍水產(chǎn)品、凍肉及其它加工食品應該前增菌。
25g＋225ml改良緩沖蛋白胨水，均質(zhì)。
30 ℃培養18－24h，移取1ml接種于100ml增菌培養液（EB)中，30 ℃培養24、48h，分別進(jìn)行分離。
直接增菌：
生乳、鮮肉以及未經(jīng)加工處理過(guò)的樣品。
25g＋225ml 增菌培養液，30 ℃培養24和48h，分別進(jìn)行分離
分離：
劃線(xiàn)接種于MMA或者OXA平板，35 ℃培養24－48h。
斜射光鏡檢。
MMA平板：藍色或者蘭灰色,扁平圓潤，稍有凸起,邊緣整齊 ，菌落較小，約為0.5mm左右
OXA平板： 菌落呈黑色，直徑1mm，在其周?chē)纬梢粋�(gè)黑色環(huán)。
從MMA或OXA上挑取5個(gè)可疑菌落，接種TSA-YE平板，進(jìn)行純培養。
純化菌落再轉接到TSB-YE肉湯，35℃培養24h。
進(jìn)行生化試驗。
典型運動(dòng)鏡檢：
從TSA-YE平板挑取生長(cháng)良好的菌落于潔凈載玻片上。
用0.85%滅菌生理鹽水制成懸浮液。
在顯微鏡下用油鏡觀(guān)察。
短棒狀桿菌，顯微鏡下可見(jiàn)輕微旋轉和翻滾。
過(guò)氧化氫酶：
過(guò)氧化氫酶又稱(chēng)接觸酶，能催化過(guò)氧化氫分解成水和氧。
菌落－平板－1滴3％的過(guò)氧化氫。陽(yáng)性。過(guò)氧化氫酶實(shí)驗也可以在試管中進(jìn)行。
革蘭氏染色鏡檢： 革蘭氏陽(yáng)性
溶血試驗：
7％羊血瓊脂平板，劃分小格，刺種菌落。做陽(yáng)性對照和陰性對照（英諾克李斯特氏菌）。
35 ℃培養24－48h，于明亮處觀(guān)察。
單核細胞增生李斯特氏菌在刺種點(diǎn)產(chǎn)生窄小的透明β溶血環(huán)。
尿素酶（Urease）試驗：
有些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。
穿刺接種尿素酶瓊脂斜面，35℃培養5天，逐日觀(guān)察，陰性。
硝酸鹽還原試驗：
某些細菌能夠把培養基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。
亞硝酸鹽與乙酸反應生成亞硝酸。
硝酸與對氨基苯磺酸作用，形成偶氮苯磺酸。
偶氮苯磺酸與α萘氨結合，形成紅色的N－α苯氨偶氮苯磺酸
接種硝酸鹽肉湯，35℃培養5天，
加入0.2ml試劑A，再加入 0.2ml試劑B，輕搖混合。
紅色：陽(yáng)性
沒(méi)有顏色變化：加入少量鋅粉
－變紅－陰性（硝酸鹽未被還原）
－不變－陽(yáng)性（亞硝酸鹽已經(jīng)分解成氨和氮）
三糖鐵（TSI）瓊脂試驗：
本試驗可同時(shí)觀(guān)察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來(lái)又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類(lèi)不被氧化，所以仍保持黃色。
三糖鐵試驗：
接種三糖鐵瓊脂，35℃培養5天。
斜面和底層產(chǎn)酸，不產(chǎn)生硫化氫。(發(fā)酵葡萄糖和蔗糖）
糖酵解試驗：
不同微生物分解利用糖類(lèi)的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣�？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗。
接種0.5%糖類(lèi)發(fā)酵管。
35℃培養24－48h，陰性繼續培養到5天。李斯特氏菌不產(chǎn)氣。
葡萄糖：陽(yáng)性
麥芽糖：陽(yáng)性
七葉苷：陽(yáng)性
甘露醇：陰性
鼠李糖：陽(yáng)性
木糖：陰性
動(dòng)力觀(guān)察：
穿刺接種半固體動(dòng)力培養基，
室溫（20－25℃）培養2－5天，逐日觀(guān)察。
有動(dòng)力。
自穿刺線(xiàn)向四周蔓延生長(cháng)，
呈典型傘狀生長(cháng)，底部為彎月牙狀。
協(xié)同凝血試驗：企業(yè)可不做。
血清學(xué)檢驗：企業(yè)可不做。
小鼠毒力試驗：企業(yè)可不做。
結果報告：
陽(yáng)性結果：檢出單核細胞增生李斯特氏菌
陰性結果：未檢出單核細胞增生李斯特氏菌
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