復方羊角片微生物限度檢查法方法學(xué)驗證試驗研究

【摘要】  方針：建樹(shù)復方羊角片微生物限度搜檢體例。體例：接納低速離心沉淀集菌與造就基稀釋聯(lián)用法、造就基稀釋法、通例法。功效：稀釋劑斗勁組和試驗組的菌接納率均年夜于80%：陰性斗勁組未檢出陰性斗勁菌，試驗組檢出陽(yáng)性試驗菌。結論：可以用該微生物限度搜檢法進(jìn)行復方羊角片的搜檢。

【關(guān)頭詞】  復方羊角片；低速離心沉淀集菌法；造就基稀釋法

Verification Test on the Technology of Microbial Limit Test　for Compound Yangjiao Tablets

　　Li Yeifeng，et al

　　Heilongjiang Renhetang Pharmaceutical Co.，Ltd(157011)

　　Abstract：Objective：To establish microbial limit test method for Compound Yangjiao Tablets.Methods：Verification test was carries out by integrated twomethods，collecting bacteria with low-speed centrifugation and nutrient medium dilution method：nutrient medium dilution method：common method.Results：The recovery rates of thinner control group and trial group are all more than 80%：The negative control group does not pick out negative bacteria control，trial group checks up positive bacteria.Conclusion：The microbial limit test method can be used dy  Compound Yangjiao Tablets.   

　　Key words：Compound Yangjiao Tablets；the method of collecting bacteria with low-speed centrifugation；Nutrent medium dilution method

　　復方羊角片系由羊角、川芎、白芷、制川烏等藥材制成的復方制劑，為偏頭痛，血管性頭痛，彌留性頭痛，神經(jīng)性頭痛的常用藥。主要身分川芎、白芷都有抑菌浸染，按通例體例測定其微生物限度無(wú)法確保功效的切確性，體例驗證是保證功效切確的獨一路子。

　　1  工具

　　1.1  儀器   

　　電熱恒溫干燥箱、電熱恒溫造就箱、高壓蒸汽滅菌鍋、低速自動(dòng)平衡離心計心情、凈化事情臺等。

　　1.2  樣品    　　

　　復方羊角片（黑龍江仁合堂藥業(yè)有限責任公司，批號：20090301）。

　　1.3  造就基   

　　營(yíng)養瓊脂造就基、玫瑰紅鈉瓊脂造就基、膽鹽乳糖造就基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）造就基、改良馬丁造就基、曙紅亞甲藍瓊脂（EMB）造就基，均購自中國藥品生物制品檢定所。造就基的制備按干燥造就基瓶簽標示體例配制及滅菌。

　　1.4  稀釋劑   

　　pH7.0無(wú)菌氯化鈉-卵白胨緩沖液、0.9%氯化鈉溶液。按中國藥典2005年版一部附錄體例配制及滅菌。

　　1.5  菌種   

　　金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、年夜腸埃希菌，白色念珠菌、黑曲霉菌均泉源于中國藥品生物制品檢定所。   

　　2  體例

　　2.1  菌液制備  分袂接種年夜腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的奇異造就物至營(yíng)養肉湯造就基中，于32℃造就24h；接種白色念珠菌的的奇異造就物至改良馬丁造就基中，于25℃造就48h，分袂取各菌種造就液1ml用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋?zhuān)�分袂�?SPAN lang=EN-US>1ml 10-5、10-6和10-7稀釋液至平皿中，傾瀉營(yíng)養瓊脂造就基，造就48h，計數；接種黑曲霉菌的奇異斜面造就物，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液5ml將孢子洗脫，羅致此溶液1ml用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋?zhuān)�分袂�?SPAN lang=EN-US>1ml 10-5、10-6和10-7稀釋液至平皿中，傾瀉玫瑰紅鈉瓊脂造就基，造就48h，計數。拔取菌落數為50～100cfu的響應稀釋級的造就液，保留備用。

　　2.2  供試液制備  稱(chēng)取樣品10 g，研細，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-卵白胨緩沖液至100 ml，制成 1∶10供試液。

　　2.3  細菌總數、霉菌及酵母菌總數搜檢體例的驗證

　　2.3.1  試驗組  ①細菌：取劃定量供試液，離心（500r/min）5min，取全數上清液加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-卵白胨緩沖液補至原量，再離心（3000r/min）20min，取舍上清液，留底部菌液約2ml，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-卵白胨緩沖液補至原量混勻，根據2005版藥典微生物限度造就基稀釋法（0.2ml/皿）磨練；②霉菌及酵母菌：取劃定量供試液，根據2005版藥典微生物限度造就基稀釋法（0.2ml/皿）磨練。

　　2.3.2  菌液組  測定所加的試驗菌數。除不加供試液外，操縱同試驗組。

　　2.3.3  供試品斗勁組測定供試品本底菌數。除不加菌液外，操縱同試驗組。

　　2.3.4  稀釋液斗勁組測定稀釋液是否干擾微生物發(fā)展。取稀釋液 l ml，別的同試驗組。   

　　三次試驗功效見(jiàn)表1、表2、表3。   

　　第一次試驗功效：   

表1  細菌、霉菌及酵母菌數驗證試驗（略）

　　第二次試驗功效：   

　　表2  細菌、霉菌及酵母菌數驗證試驗（略）

　　第三次試驗功效：   

　　表3  細菌、霉菌及酵母菌數驗證試驗（略）

　　2.4  節制菌搜檢體例的驗證

　　2.4.1  試驗組  取1∶10供試液10ml，加膽鹽乳糖造就基100ml，再加陽(yáng)性斗勁菌年夜腸埃希菌菌液（濃度同細菌、霉菌及酵母菌數驗證）1ml，搖勻，置35～37℃造就24h后作 MUG試驗及靛基質(zhì)試驗。操縱MUG造就和靛基質(zhì)試驗對年夜腸埃希菌進(jìn)行造就檢測。年夜腸埃希菌濃度同細菌、霉菌及酵母菌數驗證。

　　2.4.2  陰性菌斗勁組  體例同試驗組，金黃色葡萄球菌菌液（濃度同細菌、霉菌及酵母菌數驗證）l ml庖代年夜腸埃希菌。同時(shí)作稀釋液和造就基陰性斗勁。   

　　三次功效均齊截，見(jiàn)表4。   

　　表4  節制菌驗證試驗功效（略）

　　注：如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，果斷試驗品檢出年夜腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，果斷試驗品未檢出年夜腸埃希菌。   

　　3  功效

　　3.1  細菌總數、霉菌及酵母菌總數搜檢體例驗證5種菌株的接納率均高于80%（表1、表2、表3），合適驗證劃定。稀釋劑斗勁組的接納率（%）=（稀釋劑斗勁組平均菌落數/菌液組平均菌落數）×100%；試驗組的接納率（%）=［（試驗組平均菌落數-供試品斗勁組平均菌落數）/菌液組平均菌落數］×100%。

　　3.2  節制菌搜檢體例驗證試驗組陽(yáng)性菌斗勁檢出年夜腸埃希菌，陰性菌斗勁未檢出年夜腸埃希菌（表4），說(shuō)明本法可檢出年夜腸埃希菌，具有專(zhuān)屬性，合適驗證劃定。   

　　4  談判

　　4.1  在建樹(shù)測定體例時(shí)應詳盡某些供試品具有抑菌活性，概略影響磨練功效的切確性，必需對供試品的抑菌活性及測定體例的靠得住性進(jìn)行驗證。

4.2  若EMB平板上發(fā)展的菌落與年夜腸埃希菌形態(tài)疑似，應挑取可疑菌落進(jìn)行渙散、純化、染色鏡檢和IMViC試驗，確認年夜腸埃希菌。 

來(lái)源：《黑龍江醫藥》 

【參考文獻】

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［3］ 宋勤，袁林娜，劉應旭.口服頭孢拉定制劑微生物搜檢法研究試驗［J］.藥物剖析雜志，2005，25（6）：689-691.

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