污染是細胞培養技術(shù)中面臨的主要問(wèn)題。由于每一種細胞有其獨特的培養體系，因此污染造成的后果也不盡相同。某些污染的發(fā)生往往難以察覺(jué)和檢測，而且污染源能長(cháng)期共存于培養體系中，這類(lèi)污染事實(shí)上大部分被人們忽視了。培養的細胞作為一個(gè)生物體，會(huì )對培養環(huán)境以及環(huán)境中的污染物作出相應的反應，造成培養細胞生物學(xué)特性的改變，而對實(shí)驗結果造成潛在的威脅，而且隨著(zhù)污染時(shí)間的延長(cháng)而增加。
培養環(huán)境中的物理、化學(xué)及生物因素都可能侵入培養環(huán)境造成污染。由于入侵的微生物在培養體系中不斷增殖、代謝，因此生物性的污染對細胞的危害最大。隨著(zhù)污染微生物的不斷增殖，交叉污染的可能性也不斷增加。此外，微生物代謝消耗大量必需的養分，同時(shí)產(chǎn)生多種有毒的代謝產(chǎn)物，如酶、抗原及毒素等，進(jìn)一步對細胞產(chǎn)生毒害作用。因此，認識細胞培養污染的途徑及其危害性，建立細胞培養規范的操作方法及規章制度，可以有效地防止污染，保證實(shí)驗體系的穩定性和可靠性。
1 細胞培養基本技術(shù)
為了減少污染對細胞培養的影響，必須建立細胞凍存庫。細胞凍存庫應該分主細胞庫（Master cell bank，MCB）和工作細胞庫（Working cell bank，WCB），當需要做實(shí)驗時(shí)從主細胞庫中復蘇細胞建立工作細胞庫。每一個(gè)凍存標本都應明確記錄細胞的性質(zhì)、代數及有無(wú)污染。同時(shí)還應建立規范的檢測程序進(jìn)行菌檢及細胞鑒定［1］。
為了保證培養細胞系的完整性，必須進(jìn)行詳細的實(shí)驗記錄，應包括以下內容：細胞系的種類(lèi)及來(lái)源、有無(wú)污染（如細菌，病毒，支原體）、細胞代數和倍增時(shí)間、以及選擇性突變。詳細的記錄有利于對細胞的遺傳及生理特性在常規傳代培養中因突變、污染及各種原因導致的改變進(jìn)行分析。經(jīng)過(guò)連續傳代培養的細胞與它較早代數的凍存細胞相比，隨著(zhù)培養時(shí)間的延長(cháng)，細胞在適應環(huán)境的過(guò)程中，其生物特性已發(fā)生了改變。培養的細胞由若干生長(cháng)速度及活力各異的亞群組成。隨著(zhù)培養時(shí)間的延長(cháng)，生長(cháng)速度快及活力高的細胞亞群逐漸占優(yōu)勢，這種選擇性趨勢會(huì )影響整個(gè)細胞群的生物特性。應用不同代數的細胞連續進(jìn)行實(shí)驗則結果會(huì )發(fā)生偏差。建立細胞凍存庫就能避免這種影響，通過(guò)復蘇相同代數的細胞，人們就能在較為均一的條件下重復實(shí)驗。
細胞培養工作需要清潔，保持良好的環(huán)境及規范的操作程序［2，3］。超凈工作臺是細胞培養中普遍使用的無(wú)菌操作裝置，它需要合理的布置及經(jīng)常性的維護。超凈工作臺的工作原理是驅動(dòng)經(jīng)高效濾菌凈化后的空氣，通過(guò)工作臺面形成氣流屏障，從而阻止外界污染物的侵入并使操作過(guò)程中產(chǎn)生的飛沫限制在超凈工作臺中。因為操作過(guò)程中可能產(chǎn)生有毒的物質(zhì)，所以采用垂直氣流比水平氣流安全。
當進(jìn)行移液，傾倒液體的操作過(guò)程會(huì )產(chǎn)生飛沫，并沉積在超凈工作臺內物體的表面。超凈工作臺的氣流并不能阻止飛沫的產(chǎn)生，飛沫會(huì )隨著(zhù)氣流的方向飄浮。超凈工作臺不合理的放置、不恰當的維護以及不規范的使用會(huì )破壞超凈工作臺氣流的方向，導致飛沫更廣泛的沉積。酒精燈的火焰、操作者的活動(dòng)、談話(huà)、咳嗽及打噴嚏都有可能影響氣流。飛沫的沉積是導致超凈工作臺內物品污染的主要因素，造成潛在污染的進(jìn)一步傳播。因此為減少交叉污染的發(fā)生，應盡可能減少超凈工作臺內的物品。不同細胞系以及同一個(gè)實(shí)驗室不同操作者所使用的培養試劑一定要分開(kāi)使用，如胰酶、培養液等。否則，一個(gè)操作者的失誤可能引起所有細胞發(fā)生污染。
2 細胞培養的污染
細胞培養污染是指培養環(huán)境中侵入了對細胞生存有害的成分和造成細胞變異的異物。細胞培養污染可分為以下三類(lèi)：物理性、化學(xué)性及生物性［2，3］。為了使細胞培養的結果更可靠，應該固定所有培養條件，并保證其重復性。
2.1 物理性污染的來(lái)源、危害及預防 物理性污染常常被人們所忽視或被籠統地歸為化學(xué)性污染。物理性污染通過(guò)影響細胞培養體系中的生化成分，從而影響細胞的代謝。培養環(huán)境中的物理因素，如溫度、放射線(xiàn)、振動(dòng)、輻射(紫外線(xiàn)或熒光)會(huì )對細胞產(chǎn)生影響［2］。細胞、培養液或其它培養試劑暴露于放射線(xiàn)、輻射或過(guò)冷過(guò)熱的溫度中，可以引起細胞代謝發(fā)生改變，如細胞同步化、細胞生長(cháng)受抑制甚至細胞死亡。通過(guò)實(shí)驗室的合理設計及建立規范的操作規程，可以減少環(huán)境中物理因素對細胞的影響。孵箱應放在溫度較恒定的環(huán)境中，周?chē)荒芊胖媚芤饳C械振動(dòng)的設備，如離心機。培養液及培養試劑應放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門(mén)的冰箱中，試劑周?chē)荒芊磐凰�。培養液從冰箱中取出后應在室溫中放置一段時(shí)間后再進(jìn)行實(shí)驗，以避免過(guò)冷的溫度對細胞的影響。
2.2 化學(xué)性污染的來(lái)源、危害及預防 培養環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細胞的污染［2］�；瘜W(xué)物質(zhì)并不總是抑制細胞的生長(cháng)，某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可促進(jìn)細胞的生長(cháng)。不同細胞對化學(xué)物質(zhì)污染的反應是不一樣的。未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長(cháng)輔助因子及儲存試劑的容器都可能成為化學(xué)性污染的來(lái)源。細胞培養的必需養分，如氨基酸，若濃度超過(guò)了合適的范圍，也會(huì )對細胞產(chǎn)生毒性。同樣，不同細胞系其最佳培養條件下對血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養中應嚴格控制。玻璃制品清洗過(guò)程中殘留的變性劑或肥皂(通常殘留在瓶蓋的內表面)是最常見(jiàn)的化學(xué)性污染。
2.2.1 水 水是唯一一種在凝固時(shí)膨脹的化合物。因此在選擇凍存細胞的容器時(shí)應考慮到這個(gè)因素。容器因水的膨脹而發(fā)生破裂是引起試劑污染的重要原因。為了避免金屬離子、有機分子、細胞內毒素等物質(zhì)對水的污染，在配制液體，清洗容器時(shí)必須使用不含雜質(zhì)的超純水［4］。需要注意的是，超純水放置過(guò)久其純度會(huì )下降。
在高壓蒸氣滅菌及蒸餾水時(shí)水經(jīng)常被污染，因為高壓蒸氣鍋及純水機的常規維護后可能有少量的化學(xué)物質(zhì)殘留。為了保證水的純度，我們應采取措施盡量避免化學(xué)物質(zhì)的殘留。
2.2.2 血清 動(dòng)物血清是細胞培養中常用的天然培養基，但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來(lái)源。由于血清采集于多個(gè)動(dòng)物，而且不同廠(chǎng)商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相同，因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對不同細胞的促生長(cháng)能力及毒副作用取決于這些細胞的分化功能、組織來(lái)源及培養基的成分等因素。在進(jìn)行一系列實(shí)驗時(shí)，為了保證實(shí)驗的可重復性，最好選用同一批次的血清。
2.2.3 培養液、培養附加成分、試劑 培養液、培養附加成分、試劑都可能成為化學(xué)性污染的來(lái)源。細胞培養使用的所有物質(zhì)都應是高純度的，并經(jīng)過(guò)權威機構的鑒定，實(shí)驗者本人也應對上述成分進(jìn)行純度鑒定。同時(shí)，正確配置和儲存培養液及試劑也是非常重要的，應該采取標準的操作步驟，避免液體體積計算錯誤，混用類(lèi)似化合物等錯誤。
2.2.4 培養器皿及容器 細胞培養過(guò)程中會(huì )使用到各種不同的培養器皿及容器。培養器皿的大小，構形設計可能會(huì )影響到培養中氣體交換、濕度、培養液的pH值和細胞生長(cháng)密度。培養器皿的工藝及滅菌過(guò)程中的差異可能對培養體系產(chǎn)生影響。塑料制品在生產(chǎn)過(guò)程中可能殘留一些有毒成形劑，生產(chǎn)工藝的不同可能引起器皿表面附著(zhù)能力的不同。儲存不同物質(zhì)時(shí)應選用合適的塑料或玻璃容器，因為酒精、強酸、強堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分。
2.3 生物性污染的來(lái)源、危害及預防 外界的微生物如昆蟲(chóng)、節肢動(dòng)物、原蟲(chóng)、霉菌、病毒、細菌、無(wú)細胞壁的微生物（通常指支原體）和其它類(lèi)型的細胞都可能侵入培養環(huán)境引起污染［2，3］。只要在一個(gè)開(kāi)放的環(huán)境中進(jìn)行培養，都難以避免發(fā)生污染。發(fā)生污染的可能性取決于操作方法、培養室的無(wú)菌環(huán)境以及實(shí)驗室的規章制度。生物性污染對細胞代謝的影響，可因污染源和細胞的種類(lèi)不同而表現各異。
細菌、真菌或其它微生物污染的檢測可以用不同培養基進(jìn)行檢查［5］。支原體污染的檢測需要特殊的方法。病毒污染的檢測可以使用許多體內或體外實(shí)驗，包括大鼠或小鼠的接種、逆轉錄酶分析、凝血試驗、紅細胞吸附試驗等。
細菌和真菌的污染較易發(fā)現并及時(shí)清除，而大多數實(shí)驗室對支原體的污染缺乏足夠的認識。為了防止支原體及其它微生物污染的發(fā)生和傳播，必須建立規范的無(wú)菌操作程序及各種規章制度。支原體歸屬于柔膜體綱（Mollicutes）的支原體目，它們都具有以下共性：無(wú)細胞壁、無(wú)細胞壁主要成分——粘肽的表達。支原體與其它細菌不同之處還在于其胞膜中含有膽固醇或其它甾醇，這種特性使支原體膜更具柔順性，對于物理因素，如壓力、滲透壓、脫水的抵抗力很大［3］。支原體直徑僅有0.3～0.8 μm，并且變形能力大，故能通過(guò)濾菌器。需要指出的是，只要有一個(gè)具有增殖能力的支原體就能引起培養體系的污染。一旦細胞被污染，支原體的滴度隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)而逐漸升高，最高可至每毫升109克隆。最為致命的是，即使存在很?chē)乐氐闹гw污染，細胞外觀(guān)可無(wú)明顯變化。如果繼續使用這種已被支原體污染，而貌似正常的細胞做實(shí)驗，將會(huì )嚴重影響實(shí)驗結果。
2.3.1 來(lái)源 培養體系中支原體污染的最可能途徑是經(jīng)已被支原體污染的細胞擴散和傳播。細胞被支原體污染后，支原體可以與宿主細胞形成一個(gè)共生體系，使污染不斷擴大。一旦發(fā)生支原體污染，支原體和其它微生物會(huì )隨著(zhù)飛沫而不斷傳播。操作過(guò)程中移液，傾倒液體時(shí)都會(huì )產(chǎn)生具有潛在感染能力的飛沫，并沉積在接觸到的表面。這種污染性飛沫能存活數天甚至數星期。此外，操作失誤引起的交叉污染也是支原體污染的一個(gè)常見(jiàn)途徑。
人體的組織及體液成分是細胞培養中支原體污染的主要來(lái)源。污染的細胞中通常能分離到人類(lèi)口腔支原體、發(fā)酵支原體、唾液支原體以及其它一些與人有關(guān)的支原體，如M.buccale，M.faucium，M.homonis，M.pirum和生殖支原體等。無(wú)菌操作過(guò)程中，操作者能產(chǎn)生有污染性的隨空氣傳播的飛沫和微粒，造成培養體系的污染。人體外周血、骨髓、淋巴組織原代培養中有可能發(fā)生發(fā)酵支原體的原發(fā)污染（primary contamination），這也證明支原體在分化細胞中較未分化細胞更易生長(cháng)。隨著(zhù)培養技術(shù)的不斷發(fā)展，人們已能培養來(lái)自不同物種如動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)的各種細胞，同時(shí)也擴大了支原體及其它微生物的宿主范圍。此外，某些支原體，如菜氏無(wú)膽甾原體科（Acholeplasma laidlawii）、M.arginini、M.hyorhinis、口腔支原體、唾液支原體能寄生不同的宿主，并能在培養體系中穩定增殖數年。牛血清中能分離到A.laidlawii、M.arginini和M.hyorhinis支原體，因此血清可能成為支原體污染的來(lái)源。由于無(wú)血清培養基中許多附加成分及試劑是從血清或其它生物制品中制備的，因此無(wú)血清培養體系并不能排除支原體污染的危險。盡管隨著(zhù)培養技術(shù)的進(jìn)步，血清發(fā)生污染的可能性進(jìn)一步降低，但只要有一個(gè)活的支原體能通過(guò)濾菌器，整個(gè)培養體系就會(huì )被污染。
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