麻瘋樹(shù)提取物體外抗病毒和殺菌作用的初步研究

【摘要】  　　目的研究麻瘋樹(shù)提取物的體外抗病毒和殺菌作用，為進(jìn)一步提取分離有效成分提供實(shí)驗依據。方法采用細胞培養技術(shù)，觀(guān)察麻瘋樹(shù)1，2，3號提取物對單純皰疹Ⅰ型病毒（HSV-Ⅰ）、單純皰疹Ⅱ型病毒（HSV-Ⅱ）和流感A3型病毒（A3）的直接滅活作用以及抑制它們增殖的作用；采用懸液定量殺菌法，觀(guān)察麻瘋樹(shù)1號提取物對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的殺滅作用。結果麻瘋樹(shù)1，2，3號提取物對細胞的毒性較��；提取物既能抑制單純皰疹病毒在胞內的增殖，又能直接滅活該病毒；總體而言，提取物對HSV-Ⅰ在胞內增殖的抑制作用略?xún)?yōu)于HSV-Ⅱ，對HSV-Ⅰ的直接滅活作用更是顯著(zhù)強于HSV-Ⅱ；提取物對A3的直接滅活作用效果顯著(zhù)；3號提取物還能抑制A3在雞胚內的增殖。麻瘋樹(shù)1號提取物對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有極強的殺滅作用。結論麻瘋樹(shù)提取物具有體外抗病毒、殺菌的作用。

【關(guān)鍵詞】  麻瘋樹(shù) 提取物 抗病毒 殺菌

　　Abstract：ObjectiveTo provide an experimental evidence for further extraction  and separation of active components, we investigated the antivirus and bactericidal effects of extracts from Jatropha curcas L. in vitro. MethodsWe applied the method of cell culture to observe extracts from Jatropha curcas L., No.1,2,3, directly killing herpes simplex virus (HSV-Ⅰ&Ⅱ) and influenza virus A3, as well as inhibiting their proliferation in cells. In another experiment, we observed the bactericidal effect of No.1 extract from Jatropha curcas L. on Candida albicans, Staphylococcus aureaus and Escherichia coli.  ResultsThe extracts from Jatropha curcas L., No.1,2,3, had lower cytotoxicity. All the extracts could inhibit herpes simplex virus from proliferating in cells and directly kill the virus. Their inhibitory action on the proliferation of HSV-Ⅰwas a little better than Ⅱ, while their inhibitory effect on HSV-Ⅰwas obviously stronger than Ⅱ. All the extracts were able to kill influenza virus A3 directly, and extract No.3 could inhibit the proliferation of this virus in embryonated egg. Furthermore, No.1 extract had a very strong bactericidal effect on Candida albicans, Staphylococcus aureaus and Escherichia coli.ConclusionExtracts from Jatropha curcas L. have antivirus and bactericidal effects in vitro.

　　Key words：  Jatropha curcas L.；  Extracts；  Antivirus；  Bactericidal

    

　　麻瘋樹(shù)Jatropha curcas L.，又名黃腫樹(shù)、芙蓉樹(shù)、假花生、亮桐、嗎哄罕、桐油樹(shù)、南洋油桐，屬于大戟科（Euphorbiaceae）麻瘋樹(shù)屬Jatropha植物，主要分布于熱帶和亞熱帶地區［1］。麻瘋樹(shù)全身皆可入藥，根、莖皮和葉外用具有消腫散淤、止血、殺蟲(chóng)止癢的功能［2～4］，可用于跌打腫痛、創(chuàng )傷出血、皮膚瘙癢、濕疹等；莖葉內服還可以治療膽結石［2，5］；另經(jīng)臨床試驗證明［6］，其乳汁具有抗病毒作用。近年來(lái)還發(fā)現麻瘋樹(shù)種子具有顯著(zhù)的抗癌活性［7］。由此可見(jiàn)，麻瘋樹(shù)作為一種新興的資源植物，在新藥開(kāi)發(fā)方面具有巨大的應用價(jià)值。

　　1  材料

　　1.1  細胞非洲綠猴腎（Vero）傳代細胞，由中國中醫科學(xué)院西苑醫院基礎研究中心病毒室提供。

　　1.2  雞胚九日齡雞胚，購自中國農業(yè)科學(xué)院。

　　1.3  病毒單純皰疹Ⅰ型病毒株（HSV-Ⅰ）、單純皰疹Ⅱ型病毒株（HSV-Ⅱ) 和流感A3型病毒株（A3），由中國預防醫學(xué)科學(xué)院病毒所提供。HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ經(jīng)Vero細胞增毒后，分別收集，備用。A3經(jīng)九日齡雞胚增毒后，其紅細胞凝血效價(jià)為1∶160，收集，備用。

　　1.4  菌種白色念珠菌（Candida albicans，ATCC10231）第5代培養物，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureaus，ATCC6538）第4代培養物，大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC8099）第4代培養物，均由四川省疾病預防控制中心提供。

　　1.5  藥物麻瘋樹(shù)提取物：麻瘋樹(shù)干葉60%乙醇的浸提液，經(jīng)低壓濃縮并冷凍干燥后制得黑褐色粉末，編為1號，含生藥10 g/g。以上述浸提液為原料，以大孔樹(shù)脂吸附層析法進(jìn)行梯度洗脫，收集30%和50%乙醇洗脫的產(chǎn)物，經(jīng)低壓濃縮并冷凍干燥后制得粉末為黃綠色和棕黃色，對應編為2號和3號，分別含生藥33 g/g和100 g/g。阿昔洛韋滴眼液，1 mg/ml，武漢五景藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號為07010904。病毒唑注射液，100 mg/ml，宜昌三峽制藥廠(chǎng)生產(chǎn)，批號為20070311。

　　1.6  儀器與試劑96孔細胞培養板；CO2孵箱（日本Yamato 科學(xué)株式會(huì )社）；倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠(chǎng)，型號：1833670）；微孔濾器。DMEM干粉培養基（美國Invitrogen公司，批號：1290007）、胎牛血清、吐溫。細胞生長(cháng)液（含10％胎牛血清）、維持液、消化液以及胰酶液（含2％胎牛血清）等按《醫學(xué)病毒學(xué)基礎及實(shí)驗技術(shù)》［8］配制。胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）、磷酸鹽緩沖液（PBS）等按《消毒技術(shù)規范》［9］配制。

　　2  方法與結果

　　2.1  藥物體外抗單純皰疹病毒（HSV）實(shí)驗［8］

　　2.1.1  HSV對Vero細胞的毒力測定將長(cháng)成單層的Vero細胞用胰酶液消化成單個(gè)細胞，以細胞生長(cháng)液調整細胞數至8.0×104ml。按每孔0.1 ml加入96孔細胞培養板內，放在37℃，5%CO2孵箱中培養24 h。待96孔細胞培養板內的Vero細胞長(cháng)成單層后，取上述制備好的HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ毒株，用維持液將其分別做10倍系列稀釋(10-1～10-10)，然后按0.1 ml/孔接種于細胞培養板內的Vero單層細胞中，每濃度6個(gè)復孔，同時(shí)設細胞對照。置37℃，5%CO2孵箱中培養7 d，每日觀(guān)察并記錄細胞病變（cytopathic effect，CPE），測定組織細胞半數感染量(TCID50)。結果見(jiàn)表1。表1  單純皰疹病毒的毒力測定（略）

     按照Reed-Muench氏法［8］計算，HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ的TCID50分別為10-4.6/ml和10-3.7/ml。在“2.1.3”和“2.1.4”項實(shí)驗中，所用病毒液濃度為100 TCID50/0.1ml。

　　2.1.2  藥物對Vero細胞的毒性實(shí)驗用維持液分別將1，2，3號藥物作系列倍比稀釋?zhuān)�藥液濃度梯度�?，1，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25 mg/ml，加入96孔細胞培養板的Vero單層細胞中，0.1 ml/孔，每實(shí)驗組4個(gè)復孔，同時(shí)設細胞對照和阿昔洛韋對照（陽(yáng)性對照）。置37℃，5%CO2孵箱中培養，觀(guān)察CPE，并記錄各藥物的最大無(wú)毒濃度（TC0），共7 d。最后，按照Reed-Muench氏法［8］計算出各藥物的半數有毒濃度（TC50）。

　　經(jīng)觀(guān)察，各藥物對細胞的毒性都較小。計算得知麻瘋樹(shù)1，2，3號提取物的TC0和TC50依次為： 0.25 mg/ml和0.56 mg/ml；0.25 mg/ml和0.53 mg/ml；0.125 mg/ml和0.14 mg/ml。

　　2.1.3  藥物對HSV在細胞內增殖的抑制作用將100 TCID50/0.1 ml的HSV-Ⅰ接種于96孔細胞培養板的Vero單層細胞中，0.1 ml/孔，置37℃孵箱內吸附1 h。同時(shí)，以TC0為各藥的起始濃度，將1，2，3號藥物作系列倍比稀釋?zhuān)瑐溆�。待病毒吸附后，取出孵箱內的細胞培養板，倒掉其中液體，用維持液洗兩次，再分別加入預先稀釋的各藥液，0.1 ml/孔，每個(gè)實(shí)驗組4個(gè)復孔，同時(shí)設細胞對照、病毒對照以及阿昔洛韋對照。置37℃、5%CO2孵箱中培養，每日觀(guān)察CPE，當病毒對照組的CPE達“++++”時(shí)，（注：“－”表示無(wú)細胞病變； “+”表示有25%細胞病變；“++”表示有50%細胞病變；“+++”表示有75%細胞病變；“++++”表示有100%細胞病變。）終止實(shí)驗。按照上述方法，以HSV-Ⅱ進(jìn)行相同實(shí)驗操作。結果見(jiàn)表2。并根據Reed - Muench 氏法［8］計算出1，2，3號藥物對不同病毒的EC50 (半數有效濃度) ，以治療指數(TI，therapeutic index)來(lái)評價(jià)藥物抑制病毒在細胞內增殖的作用，記為T(mén)I1，TI1= TC50/ EC50。結果見(jiàn)表3。表3   麻瘋樹(shù)提取物抑制單純皰疹病毒增殖的治療指數（略）

    由表2可見(jiàn)，1，2，3號藥物均能抑制HSV在細胞內的增殖。其中1號和2號藥物在0.25 mg/ml時(shí)能夠100%抑制病毒的增殖，而3號藥物在0.062 5 mg/ml即可達到完全抑制病毒增殖的作用。由表3可見(jiàn)，藥物對HSV-Ⅰ的治療指數以3號最高，達7.00，1號最低，僅為3.11。此外，1號和3號藥物對HSV-Ⅱ的治療指數相同，均為3.50，略高于2號藥物的3.31�？傮w而言，2號和3號藥物對HSV-Ⅰ在細胞內增殖的抑制作用強于對HSV-Ⅱ的抑制作用。表2  麻瘋樹(shù)提取物對單純皰疹病毒在細胞內增殖的抑制作用（略）

　　2.1.4  藥物對HSV的直接滅活作用將預先稀釋的1，2，3號藥物液（稀釋方法同“2.1.3”項）與100 TCID50/0.1 ml的HSV-Ⅰ病毒液等量混合，置37℃溫箱內1 h。然后接種于96孔細胞培養板的單層Vero細胞中，0.2 ml/孔，每個(gè)實(shí)驗組4個(gè)復孔，同時(shí)設細胞對照、病毒對照以及阿昔洛韋對照。再放入37℃孵箱吸附1h。取出，倒掉其中液體，用維持液洗兩次后，將維持液按0.1ml/孔加到細胞培養板內，置37℃，5% CO2孵箱中培養，每日觀(guān)察記錄CPE，當病毒對照組的CPE達“++++”時(shí)，終止實(shí)驗。按照上述方法，以HSV-Ⅱ進(jìn)行相同實(shí)驗操作。結果見(jiàn)表4。計算出1，2，3號藥物對病毒的半數有效濃度，記為EC50。同樣以治療指數來(lái)評價(jià)藥物對病毒的直接殺傷作用，記為T(mén)I2，TI2 = TC50/ EC50。結果見(jiàn)表5。表5  麻瘋樹(shù)提取物直接滅活單純皰疹病毒的治療指數（略）

　　由表4可見(jiàn)，所有藥物都能將HSV直接滅活。1號和2號藥物在濃度為0.062 5 mg/ml時(shí)能滅活所有HSV-Ⅰ，在0.25 mg/ml時(shí)能滅活全部HSV-Ⅱ。而3號藥物在0.015 6 mg/ml時(shí)能滅活HSV-Ⅰ達100%，濃度達到0.062 5 mg/ml時(shí)能完全滅活HSV-Ⅱ。由表5可見(jiàn)，所有藥物對HSV-Ⅰ直接滅活的治療指數顯著(zhù)高于HSV-Ⅱ。在對HSV-Ⅰ的直接滅活中，1號和3號藥物的治療指數較高，為14.00，2號藥物的指數略低，為13.25。表4   麻瘋樹(shù)提取物對單純皰疹病毒的直接滅活作用（略）

　2.2  藥物體外抗流感A3型病毒（A3）實(shí)驗［8］

　　2.2.1  A3對雞胚的毒力測定取上述制備好的A3，用生理鹽水作10倍系列稀釋(10-1～10-10)，然后將不同濃度的病毒接種于九日齡雞胚中，0.1 ml/胚，每濃度4個(gè)復胚，同時(shí)設空白對照。以蠟封住注射孔，放33℃溫箱中培養48 h，然后置于4℃冰箱中過(guò)夜，次日取出，取尿囊液，用0.5%雞紅細胞作血凝試驗，并計算病毒血凝滴度。

     經(jīng)計算，病毒致雞胚半數感染量（EID50）為10-4/ml。在“2.2.3”和“2.2.4”項實(shí)驗中，所配A3濃度為50EID50/0.1 ml。

　　2.2.2  藥物對雞胚的毒性測定用生理鹽水將1，2，3號藥物作系列倍比稀釋?zhuān)�藥液濃度梯度�?0，20，10，5和2.5 mg/ml。將不同濃度的藥物注入九日齡雞胚中，0.1 ml/胚，每實(shí)驗組4個(gè)重復，同時(shí)設空白對照和病毒唑對照（陽(yáng)性對照）。以蠟封住注射孔，放33℃溫箱中培養48 h后，取出，敲碎蛋殼，觀(guān)察記錄雞胚的存活情況。

     經(jīng)過(guò)觀(guān)察，1，2，3號藥物對雞胚的TC0均為20 mg/ml，計算得出它們的TC50依次為28.17，28.57和50 mg/ml。

　　2.2.3  藥物對A3在雞胚內增殖的抑制作用將50EID50/0.1ml的A3接種于九日齡雞胚中，0.1 ml/胚，放33℃吸附1 h。同時(shí)，以20 mg/ml為各藥物的起始濃度，用生理鹽水將1，2，3號藥物作系列倍比稀釋?zhuān)瑵舛忍荻葹?0，10，5，2.5，1.25和0.625 mg/ml，備用。待病毒吸附時(shí)間一到，將稀釋好的藥物注入雞胚內，0.1 ml/胚，每實(shí)驗組4個(gè)重復，同時(shí)設空白對照、病毒對照和病毒唑對照。以蠟封住注射孔，放33℃溫箱中培養48 h，然后置于4℃冰箱中過(guò)夜，次日取出，取雞胚尿囊液，用0.5%雞紅細胞測血凝。結果見(jiàn)表6。計算出1，2，3號藥物的EC50 (半數有效濃度) ，并以治療指數(TI)來(lái)評價(jià)藥物對病毒在細胞內增殖的抑制作用，記為T(mén)I3，TI3 = TC50/ EC50。結果見(jiàn)表7。表7  麻瘋樹(shù)提取物對流感A3型病毒的治療指數（略）

 

    由表6可見(jiàn)，1號和2號藥物均不能抑制A3在雞胚內的增殖，只有3號藥物在20 mg/ml時(shí)可完全抑制A3的增殖。如表7所示，3號藥物對流感A3型病毒的治療指數為5.66。表6  麻瘋樹(shù)提取物對流感A3型病毒在雞胚內增殖的抑制作用（略）

　　2.2.4  藥物對A3的直接滅活作用將稀釋好的1，2，3號藥物（稀釋方法同“2.2.3”項）與50EID50/0.1 ml的A3等量混合，置33℃溫箱中和1 h。然后接種于九日齡雞胚中，0.2 ml/胚，每實(shí)驗組4個(gè)重復，同時(shí)設空白對照、病毒對照和病毒唑對照。以蠟封住注射孔，放33℃溫箱培養48 h，然后置于4℃冰箱中過(guò)夜，次日取出，取雞胚尿囊液，用0.5%雞紅細胞測血凝效價(jià)。結果見(jiàn)表8。計算出1，2，3號藥物的EC50 (半數有效濃度) ，以治療指數(TI)來(lái)評價(jià)藥物對病毒的直接滅活作用，記為T(mén)I4，TI4= TC50/ EC50。結果見(jiàn)表9。表9  麻瘋樹(shù)提取物對流感A3型病毒的中和指數（略）

    由表8可見(jiàn)，1號藥物在0.5 mg/ml時(shí)能滅活所有A3，2號藥物在1 mg/ml時(shí)才能將全部病毒滅活，而3號藥物在0.125 mg/ml時(shí)即可100%滅活病毒。因此，如表9所示，3號藥物直接滅活A3的治療指數高達1 250.00，1號藥物次之，為78.25，而2號藥物的治療指數最低，為69.68。表8  麻瘋樹(shù)提取物對流感A3型病毒的直接滅活作用（略）

　　2.3  藥物體外殺菌實(shí)驗［10］

　　2.3.1  菌懸液的配制刮取白色念珠菌的平板培養物, 以胰蛋白胨生理鹽水溶液（TPS）稀釋成菌懸液。搖勻后，采用活菌培養計數，然后以TPS液稀釋至實(shí)驗所需濃度，1×108～5×108 cfu/ml。按照同樣的方法，制備金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌懸液。

　　2.3.2  藥液的配制取適量1號藥物，以無(wú)菌蒸餾水配制成濃度為150 mg/ml的溶液。2.3.3  麻瘋樹(shù)根提取物1號的殺菌實(shí)驗以蒸餾水配制3%的牛血清白蛋白溶液作為有機干擾物質(zhì)。取一支無(wú)菌大試管，先加入0.5 ml白色念珠菌懸液，再加入0.5 ml有機干擾物質(zhì)，混勻，置 20℃水浴5 min后，用無(wú)菌吸管吸取預先配制的藥液4.0 ml 注入其中，迅速混勻并立即記時(shí)。以同樣的方法，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行實(shí)驗操作。

    以含0.5％卵磷脂＋2％吐溫－80的0.03 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.03 mol/L，pH7.2）為中和劑。待實(shí)驗細菌與藥液相互作用1 min后，分別吸取0.5 ml實(shí)驗菌懸液與藥液的混合液加于 4.5   ml 經(jīng)滅菌的中和劑中，混勻。10 min 后，分別吸取1.0 ml樣液，按活菌培養計數法測定存活菌數。重復上述操作，但將實(shí)驗細菌與藥液相互作用時(shí)間延長(cháng)至2 min和3 min，最后再進(jìn)行活菌計數。同時(shí)用TPS液代替藥液，進(jìn)行平行試驗，作為陽(yáng)性對照，其活菌培養計數結果代表菌懸液原有濃度，將其作為計算殺滅對數的初始濃度。所有實(shí)驗組均在37℃溫箱中培養，48 h后觀(guān)察結果。

     實(shí)驗重復3次，計算各組的活菌濃度（cfu/ml），并換算為對數值（N），然后按下式計算殺滅對數值:

　　殺滅對數值 (KL)＝對照組平均活菌濃度的對數值（No）－試驗組活菌濃度對數值（Nx）

    由表10可見(jiàn)，1號藥物對白色念珠菌作用1 min則可達到100%的平均殺滅率，對金黃色葡萄球菌作用1 min后其平均殺滅率為99.77%，繼續作用至3 min末則可達到99.77%的平均殺滅率，而對大腸桿菌作用1 min即達到99.98%的平均殺滅率，繼續作用至2 min末其殺滅率提高至99.99%，作用時(shí)間持續到3 min末其殺滅率仍為99.99%，不再變化。表10  麻瘋樹(shù)提取物1號的殺菌效果（略）

　

　　3  討論

    單純皰疹病毒是人體重要致病病毒，能引起口唇皰疹、生殖器皰疹、腦炎及內臟器官的感染。流感病毒所引發(fā)的流行性感冒是一種急性呼吸道疾病，具有發(fā)病快、傳染性強、發(fā)病率高的特點(diǎn)，臨床癥狀多為高熱、寒戰、頭痛、全身關(guān)節痛等。這兩類(lèi)病毒都嚴重威脅著(zhù)人類(lèi)健康，但至今仍缺乏針對它們的有效抗病毒藥物。本研究旨在從植物資源中提取出安全而有效的抗病毒活性成分，從而為上述疾病的臨床治療提供更多更好的選擇。

    以上研究表明，麻瘋樹(shù)提取物能有效抑制單純皰疹病毒的增殖，效果雖不比阿昔洛韋，但對該病毒直接滅活作用效果卻明顯優(yōu)于阿昔洛韋。麻瘋樹(shù)提取物還對流感病毒具有顯著(zhù)的直接滅活作用。此外，該提取物還具有強效殺菌作用。綜上所述，麻瘋樹(shù)提取物在抗病毒藥物以及外用殺菌噴劑的開(kāi)發(fā)方面具有良好的應用前景。

作者：劉娟 雷蕾 唐琳 李昱星 陳放  《時(shí)珍國醫國藥》

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