嗜酸乳桿菌推定的β-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中的功能性表達

【摘要】  目的 在大腸桿菌中誘導表達以嗜酸乳桿菌克隆β�舶肴樘擒彰富�因lacZ，為研究其酶學(xué)特性做準備。方法 從嗜酸乳桿菌ATCC 4356中克隆lacZ基因，并構建表達載體pET22b�瞝acZ�睭、pQE31�睭�瞝acZ和pQE31�瞝acZ，然后在大腸桿菌中誘導表達，并測定表達產(chǎn)物的β�舶肴樘擒彰富钚�。結果 無(wú)標簽的重組嗜酸乳桿菌β�舶肴樘擒彰窵acZ獲得了功能性表達，表達量可達2.28 kU/L.而融合His�睺ag的重組嗜酸乳桿菌LacZ卻失去了β�舶肴樘擒彰富钚�，即使復性也不能恢復。結論 克隆表達的成功為該酶的酶學(xué)性質(zhì)研究和可能的應用打下了基礎。

【關(guān)鍵詞】  嗜酸乳桿菌； β�舶肴樘擒彰�； 克隆表達； His�睺ag；復性

    【Abstract】  Objective To clone and express the lacZ gene of L. acidophilus in E. coli for research of the properties of the putative β�瞘alactosidase. Methods  The lacZ gene was cloned from L. acidophilus ATCC 4356 and was inserted into three recombinant vectors: pET22b�瞝acZ�睭, pQE31�睭�瞝acZ and pQE31�瞝acZ. The recombinant proteins were induced and were identified by SDS�睵AGE and β�瞘alactosidase assay. Results The recombinant lacZ without tag was expressed as functional β�瞘alactosidase, which yield was 2.28 kU/L, but the two recombinant LacZs with His�瞭ag were expressed as proteins without activity and its activity could not recovery by renaturation. Conclusion The study make a base for research of enzymatic properties and probable application in the future.

    【Key words】  Lactobacillus acidophilus;  β�瞘alactosidase;  expression;  His�睺ag;  renaturation

    β-半乳糖苷酶(β�瞘alactosidase，EC 3.2.1.23)因為能水解牛奶中的乳糖而廣泛的應用于乳品工業(yè)［1,2］，又因為便利的顯色反應而普遍應用于分子生物學(xué)研究［3,4］。尋找新的β�舶肴樘擒彰缚梢源龠M(jìn)分子生物學(xué)研究和乳品工業(yè)發(fā)展。

    最近嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）NCFM菌株基因組DNA（GenBank accession No. CP000033)已完成測序［5］。該菌基因組攜帶有3個(gè)推定的β�舶肴樘擒彰妇幋a基因：lacA、lacZ和lacLM。已知lacLM基因編碼的β�舶肴樘擒彰甘窃摼�降解乳糖的主要酶［6,7］，而lacZ基因卻功能不明。迄今為止，還沒(méi)有關(guān)于該基因編碼產(chǎn)物的研究報道。嗜酸乳桿菌lacZ基因和著(zhù)名的大腸桿菌（Escherichia coli）lacZ基因雖然同名，其序列卻沒(méi)有相似性。該基因相似于極端環(huán)境微生物的屬于糖苷水解酶42家族（glycoside hydrolase family 42，GH42）的β�舶肴樘擒彰富�因。極端環(huán)境微生物中的GH42 β�舶肴樘擒彰敢蚰蜔幔�8］、耐鹽［9］、耐低溫［10］或有特殊的底物而受到關(guān)注。嗜酸乳桿菌β�舶肴樘擒彰窵acZ可能同極端環(huán)境微生物的GH42 β�舶肴樘擒彰敢粯�，具有某種獨特的性質(zhì)，從而應用于分子生物學(xué)研究或乳品工業(yè)。

    本實(shí)驗設計了3個(gè)克隆表達載體，試圖在大腸桿菌中大量表達嗜酸乳桿菌GH42β�舶肴樘擒彰窵acZ，旨在為后續的酶學(xué)性質(zhì)研究提供依據。

    1  材料與方法

    1.1  菌株和質(zhì)粒

    嗜酸乳桿菌ATCC 4356購自中科院微生物研究所菌種保藏庫，培養條件為：在37 ℃下，于MRS培養液［6］中靜置培養24～48 h.大腸桿菌JM109和Rosetta菌株是本實(shí)驗室保存，培養條件為：在37 ℃下，于LB培養液中搖振培養過(guò)夜。選用本實(shí)驗室保存的質(zhì)粒pET22b和pQE31為表達載體。篩選條件為100 μg/ml的氨芐青霉素。

    1.2  嗜酸乳桿菌β�舶肴樘擒彰富�因的PCR擴增

    嗜酸乳桿菌基因組DNA的提取方法參考文獻［11］。用嗜酸乳桿菌ATCC 4356的基因組DNA為模板，加入下列引物擴增嗜酸乳桿菌lacZ基因： P1:5′�睠AGGATCCGATGACACAATTATCACG��

    TTTTC��3′；P2:5′�睪GCTCGAGATTTCTCAATA��

    CTTGAACATCC��3′；P3:5′�睪CCTGCAGCTAAT��

    TTCTCAATACTTGAACATCC��3′；P4:5′�睠CGA��

    ATTCTAGAGGAAATAAAATGACACAATTA��

    TCACG��3′.P1和P2擴增的是不帶終止密碼子的lacZ基因的編碼序列，擴增片段長(cháng)2 018 bp；P1和P3擴增的是帶有終止密碼子的lacZ基因編碼序列，擴增片段長(cháng)2 021 bp；P4和P3擴增的是從lacZ的RBS到終止密碼子之間的序列，擴增片段長(cháng)2 033 bp.PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸130 s，共20個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.凝膠電泳檢測PCR結果，PCR純化試劑盒回收目的條帶。

    1.3  嗜酸乳桿菌β�舶肴樘擒彰副磉_載體構建

    分別用對應的內切酶對PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行雙酶切，膠回收后用T4DNA連接酶連接，再將連接產(chǎn)物電轉化入宿主菌株。共構建3個(gè)重組質(zhì)粒(見(jiàn)圖1)：（a）是pET22b�瞝acZ�睭，由P1和P2擴增的片斷和pET22b連接構成，lacZ基因置于T7啟動(dòng)子控制下，5′端帶有果膠酶信號肽序列，3′端帶有His�睺ag.轉化Rosetta菌株，以含氨芐青霉素的LB平板篩選。（b）是pQE31�睭�瞝acZ，由P1和P3引物對擴增的片斷和pQE31連接而成，lacZ基因置于T5啟動(dòng)子控制下，5′端帶有His�睺ag.（c）是pQE31�瞝acZ，由P4和P3引物對擴增的片斷和pQE31連接而成，lacZ基因置于T5啟動(dòng)子控制下，自帶RBS位點(diǎn)，5′端和3′端沒(méi)有任何標簽和多余序列。（b）和（c）轉化JM109菌株，以含氨芐青霉素、X�睪al和IPTG的LB平板篩選。雙酶切和PCR初步鑒定重組質(zhì)粒，并送上海生工公司測序鑒定。

    1.4  重組嗜酸乳桿菌β�舶肴樘擒彰傅恼T導表達

    誘導方案為：誘導溫度設為37 ℃、30 ℃、25 ℃和20 ℃；誘導劑IPTG濃度設為：0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L；培養基設為含0.5 %乳糖的LB培養基和普通LB培養基。120 r/min搖床培養重組菌株pET22b�瞝acZ�睭/Rosetta、pQE31�睭�瞝acZ/JM109和pQE31�瞝acZ/JM109各10 ml，培養至OD600≈0.6，加IPTG誘導8 h.取3 ml表達菌液，6 000×g離心2 min收集菌體，再用300 μl ddH2O將菌體混懸均勻，在冰上用超聲波破碎菌體，12 000×g離心30 min，收集上清液測定其β�舶肴樘擒彰副然盍�。重懸的超聲沉淀、超聲上清液和重懸的菌體一并做SDS�睵AGE分析。用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。

    1.5  重組β�舶肴樘擒彰傅拿富钚詼y定

    酶活性測定方法根據文獻［12］修改：在200 μl反應液（22 mmol/L ONPG，50 mmol/L Na3PO4，pH 6.6）中加入10 μl適當稀釋的試驗樣品，37 ℃溫育10 min后，加入450 μl濃度為0.4 mol/L的Na2CO3溶液終止反應，于420 nm處測定OD值。設定在該反應條件下，每分鐘釋放1 μmol鄰硝基苯酚為1個(gè)酶活單位（U）。

    1.6  包涵體表達的重組β�舶肴樘擒彰傅奶崛『蛷托�

    根據誘導表達實(shí)驗結果，在37 ℃培養構建的3株重組菌株各500 ml，加終濃度為0.4 mmol/L的 IPTG誘導表達8 h，然后離心收集表達菌體，用buffer A（50 mmol/L Tris·Cl， 50 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，5 %甘油，pH 8.0）洗滌后，在冰浴中超聲破菌。然后按照文獻［13］的描述，用Triton X��100提取和洗滌包涵體，再用尿素溶解包涵體。將包涵體溶解液在逐漸降低變性劑濃度的溶液中透析復性：透析液Ⅰ(2 mol/L尿素，20 mmol/L Tris·Cl，0.1 mmol/L GSSG，0.9 mmol/L GSH， pH 8.0)，透析液Ⅱ(0.5 mol/L尿素，20 mmol/L Tris·Cl，0.1 mmol/L GSSG，0.9 mmol/L GSH，pH 8.0)，透析液Ⅲ（50 mmol/L Tris·Cl，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，70 μl/L β�矌�基乙醇，pH 8.0）。SDS�睵AGE電泳和β�舶肴樘擒彰富钚詼y定檢測效果。用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。

    2.1  嗜酸乳桿菌β�舶肴樘擒彰富�因的表達載體

    以嗜酸乳桿菌基因組DNA為模板的3個(gè)PCR均得到了預期條帶。酶切、連接和電轉化后，均篩選到了轉化子。其中pQE31�瞝acZ/JM109的轉化子在篩選平板上呈現為藍色菌落；而pQE31�睭�瞝ac Z/JM109的轉化子在篩選平板上仍然呈現為白色菌落。這個(gè)現象提示pQE31�瞝ac Z/JM109菌株表達了有活性的重組β�舶肴樘擒彰�，而pQE31�睭�瞝ac菌株表達的重組β�舶肴樘擒彰缚赡軟](méi)有活性。雙酶切、PCR（見(jiàn)圖2）及測序證實(shí)3種重組質(zhì)粒pET22b�瞝acZ�睭、pQE31�睭�瞝acZ和pQE31�瞝acZ均構建成功。測序表明克隆序列和嗜酸乳桿菌NCFM菌株lacZ序列100 %相同。序列提交GenBank，登錄號為：EU590652.

    2.2  重組嗜酸乳桿菌β�舶肴樘擒彰傅谋磉_形式

    經(jīng)檢測，在各誘導條件下，菌株pET22b�瞝acZ�睭/Rosetta的超聲上清液的β�舶肴樘擒彰副然盍�和對照菌株（pET22b /Rosetta）超聲上清液的β�舶肴樘擒彰副然盍Χ紱](méi)有顯著(zhù)區別，表明該重組菌株很可能不表達有活性的重組LacZ.SDS�睵AGE結果顯示在全菌樣品和超聲沉淀樣品中均存在一個(gè)顯著(zhù)的約70 kDa（接近嗜酸乳桿菌LacZ的理論分子量76 583 Da）的表達條帶，但是在超聲上清液中卻沒(méi)有明顯的70 kDa表達條帶（見(jiàn)圖3B）。因此判定C端融合His�睺ag的重組LacZ的表達形式為包涵體表達。

    pQE31�睭�瞝acZ/JM109在各誘導條件下的超聲上清液中都測不到β�舶肴樘擒彰该富�，表明該重組菌株不能表達有活性的重組LacZ.SDS�睵AGE顯示了和pET22b�瞝acZ�睭/Rosetta相似的結果（見(jiàn)圖3A），因此判定N端融合His�睺ag的重組LacZ的表達形式也為包涵體表達。

    pQE31�瞝acZ/JM109在各誘導條件下均能在超聲上清液中檢測到β�舶肴樘擒彰该富钚�，說(shuō)明該菌株實(shí)現了無(wú)標簽重組LacZ的可溶性表達。在誘導條件為25 ℃、0.4 mmol/L IPTG和含0.5 %乳糖的LB培養基時(shí)，超聲上清液中β�舶肴樘擒彰富钚宰罡�，比活力達到1.14 U/mg。據此推算，誘導后菌液中的β�舶肴樘擒彰竼挝患s為2.28 kU/L.SDS�睵AGE顯示在超聲上清液中有明顯的表達條帶（見(jiàn)圖3D）。不過(guò)在37 ℃下卻主要為包涵體表達，超聲上清液中的表達條帶減弱（見(jiàn)圖3C）。相應的，超聲上清液的β�舶肴樘擒彰副然盍σ蚕陆档�0.18 U/mg.

    2.3  包涵體表達的重組蛋白的復性

    C端標記LacZ經(jīng)透析復性后，測得復性后的目標蛋白溶液的濃度為0.43 mg/ml.酶活性測定表明復性蛋白沒(méi)有β�舶肴樘擒彰富钚�。N端標記LacZ經(jīng)透析復性后，測得復性后的目標蛋白溶液的濃度為0.35 mg/ml.酶活性測定表明復性蛋白也沒(méi)有β�舶肴樘擒彰富钚�。而無(wú)標簽重組LacZ經(jīng)透析復性后，測得復性后的目標蛋白溶液的濃度為1.16 mg/ml.酶活性測定表明復性蛋白溶液β�舶肴樘擒彰富钚院�量為10.1 U/ml，比活力為8.72 U/mg.

    3  討論

    重組菌株pQE31�瞝acZ/JM109在篩選板上長(cháng)出藍色菌落；誘導后，其超聲上清液具有β�舶肴樘擒彰富钚裕�1.14 U/mg，25 ℃），SDS�睵AGE圖上顯示了明顯的重組嗜酸乳桿菌LacZ條帶（70 kDa）；表達為包涵體的重組嗜酸乳桿菌LacZ也復性成功（8.72 U/mg）。這一組實(shí)驗結果表明無(wú)標簽的重組嗜酸乳桿菌LacZ實(shí)現了功能性表達。

    重組菌株pQE31�睭�瞝acZ/JM109和pET22b�瞝acZ�睭/Rosetta雖然都在SDS�睵AGE圖上顯示了明顯的重組嗜酸乳桿菌LacZ條帶（70 kDa），但是在超聲上清液中卻沒(méi)有重組β�舶肴樘擒彰富钚�。這說(shuō)明重組蛋白的表達形式是包涵體。在包涵體復性實(shí)驗中，兩種重組β�舶肴樘擒彰福℉�睱acZ和LacZ�睭）都不能測得酶活性。說(shuō)明這兩種重組β�舶肴樘擒彰付紱](méi)能重折疊為有活性的構象。比較無(wú)標簽重組LacZ的成功復性，作者推論，很可能是融合的His�睺ag阻礙了重組蛋白的正確折疊。利用NCBI網(wǎng)站的保守結構域檢索工具進(jìn)行檢索，發(fā)現嗜酸乳桿菌LacZ的C端和N端均存在保守結構域，分別稱(chēng)為GH42 β�舶肴樘擒彰窷端結構域和GH42 β�舶肴樘擒彰窩端結構域。顯然His�睺ag對這兩個(gè)結構域的影響是復性失敗的可能原因。

    重組質(zhì)粒pQE31�瞝acZ的克隆方式是獨特的。該克隆方式可確保重組蛋白的氨基酸序列不會(huì )因克隆帶上附加序列。如果只利用pQE31質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)(MCS)的酶切位點(diǎn)構建重組質(zhì)粒，表達的重組蛋白的N端將帶上有利于純化的His�睺ag.但是His�睺ag有可能會(huì )影響重組蛋白的活性。如果利用pQE31質(zhì)粒lacO與RBS之間的Eco R I酶切位點(diǎn)和MCS上的任意酶切位點(diǎn)構建重組質(zhì)粒，就能切掉pQE31質(zhì)粒的His�睺ag和RBS位點(diǎn)。在目標片段上帶上RBS，表達的重組蛋白將沒(méi)有任何附加的氨基酸殘基，這就確保不會(huì )因克隆而導致重組蛋白不同于親本蛋白。若為了研究蛋白的活性而進(jìn)行的克隆，顯然這個(gè)克隆策略最好。

    嗜酸乳桿菌β�舶肴樘擒彰窵acZ和極端環(huán)境微生物的GH42 β�舶肴樘擒彰笇儆谕�一糖苷水解酶家族，很可能該酶像極端環(huán)境微生物的GH42 β�舶肴樘擒彰敢粯泳哂辛钊烁信d趣的酶學(xué)特性。目前還沒(méi)有該酶的克隆表達報道。本文設計了3個(gè)表達載體，表達了3種重組LacZ，分別為N端標記His�睺ag、C端標記His�睺ag和無(wú)標簽的重組LacZ.其中無(wú)標簽重組LacZ實(shí)現了功能性表達，為該酶的酶學(xué)性質(zhì)研究和可能的應用打下了基礎。

作者：潘渠  胡福泉  陳恬  邱岳  王廣科  李晉川《成都醫學(xué)院學(xué)報》

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