石韋醇提物抑菌活性的初步研究

【摘要】  目的研究石韋地上部醇提物的石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水4個(gè)極性部位對大腸桿菌、普通變形桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌、黃曲霉、青霉、黑曲霉等 8種常見(jiàn)菌的抑制作用。方法采用紙片擴散法進(jìn)行抑菌試驗，觀(guān)察并測量抑菌環(huán)的大小。結果石韋醇提物的醋酸乙酯、正丁醇和水相萃取物對供試細菌均有不同程度的抑制作用。其中正丁醇相萃取物和水相萃取物的抑菌效果較好。石油醚相萃取物對這8種供試菌均無(wú)明顯抑菌效果，各相萃取物對黃曲霉、青霉和黑曲霉也沒(méi)明顯抑菌效果。結論較強極性的提取物對5 種細菌抑菌效果較為突出。

【關(guān)鍵詞】  石韋； 極性部位； 抑菌活性

         石韋 Pyrrosia lingua（Thunb.）Farw.又名金茶匙、小葉石韋、象皮草、石茶、牛皮茶等，為水龍骨科多年生常綠附生草本蕨類(lèi)，作為常用中藥之一，石韋主治腎炎水腫、膀胱炎、泌尿系結石、肺性氣管炎，哮喘、肺膿瘍、咯血、吐血和尿血等［1］。我國石韋資源豐富，在廣西境內分布較廣，武鳴、藤縣、金秀、桂平、梧州、資源和環(huán)江均有分布，主要生長(cháng)在海拔100～1 800 m的石壁或樹(shù)干上。據研究，石韋的主要藥用成分是芒果苷（具抗菌、抗單純皰疹病毒）、異芒果苷（鎮咳祛痰、抗單純皰疹病毒作用）、綠原酸（抗菌、興奮中樞神經(jīng)等作用）［2～4］，但有關(guān)石韋化學(xué)成分的抑菌性研究卻很少，藥用狀況復雜，為深入開(kāi)發(fā)這一豐富自然資源，本文對石韋地上部醇提物石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水不同極性溶劑得到的各部位提取物進(jìn)行抑菌活性研究，以期探明石韋主要抑菌活性成分的極性部位和適宜的提取溶劑，并為石韋的合理開(kāi)發(fā)提供依據。

　　1  儀器與材料

　　1.1  儀器與材料

　　超凈工作臺、手提式滅菌鍋、恒溫控制箱、冰箱、游標卡尺、鑷子、接種針、三角瓶等；石油醚、醋酸乙酯、乙醇、正丁醇等試劑均為分析純。實(shí)驗材料于2007��11 采自廣西武鳴大明山國家級水源林保護區海拔1 200 m的沿路石壁上或亂石堆環(huán)境中，經(jīng)廣西大學(xué)植物分類(lèi)學(xué)黎樺副教授鑒定為石韋P. lingua，將地上部洗凈，自然風(fēng)干后磨成粉末，過(guò)40目篩備用。

　　1.2  供試菌種

　　供試細菌：大腸桿菌Escherichia coli，普通變形桿菌Proteus vulgaris，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，藤黃八疊球菌Sarcina lutea。供試真菌：黃曲霉Aspergillus flavas，青霉Penicillium sp.，黑曲霉Aspergillus niger。

   

　　以上菌種均由廣西大學(xué)農學(xué)院植物保護系微生物學(xué)實(shí)驗室提供。

　　1.3  培養基細菌用營(yíng)養瓊脂培養基培養，真菌用馬鈴薯培養基［5］培養。

　　2  方法

　　2.1  菌懸液或孢子懸液制備采用平板菌落計數法［5］。將受試菌在斜面培養基活化2～3代后，用接種環(huán)從斜面上刮菌苔兩環(huán)，分別收集到內盛有100 ml無(wú)菌水的250 ml的三角瓶中，將受試菌配成終濃度0.1×107個(gè)/ml的菌懸液，備用。

　　2.2  樣液制備石韋地上部醇提取物不同極性部位的制備：稱(chēng)取粉碎好的石韋樣品4 kg，用體積分數90%乙醇將樣品浸泡3次（料液比 1∶15），每次7 d ，提取液在40°C下減壓蒸餾，回收溶劑，得乙醇浸膏。將乙醇浸膏懸浮于蒸餾水，先后用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和蒸餾水萃取，分別得石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水4部分萃取物，同前濃縮，即得各極性部位。

　　2.3  石韋抗菌作用的檢測方法采用紙片擴散法進(jìn)行抑菌試驗［6］。在超凈工作臺上將滅菌后的牛肉蛋白胨培養基倒入培養皿中，每皿15 ml，放置冷卻。用無(wú)菌移液管取0.1 ml細菌液加于平皿中均勻涂布于平板（內徑 90 mm）表面后。取經(jīng)滅菌的標準濾紙（直徑 6 mm），分別蘸取石韋醇提物的不同極性部位并貼于平板表面，每個(gè)培養皿放3片濾紙，以蒸餾水、石油醚為對照液。細菌于37℃培養24 h 、真菌于28℃培養48 h后，檢測抑菌環(huán)的有無(wú)并測量抑菌環(huán)直徑，每種提取液對8種供試菌重復測定3次，結果取平均值。出現抑菌環(huán)的菌株才作MIC檢測。

　　2.4  最小抑菌質(zhì)量濃度的檢測采用紙片擴散法方法同“2.3”，將各溶液稀釋成100，50，25，12.5，6.25，3.125 mg/ml 的質(zhì)量濃度梯度，以未見(jiàn)抑菌環(huán)的最高質(zhì)量濃度為MIC。

　　3  結果

　　3.1  不同極性部位的抑菌活性的比較對石韋地上部醇提物不同極性部位的抑菌活性進(jìn)行比較, 這4種溶劑極性大小為：石油醚＜醋酸乙酯＜正丁醇＜水。從表 1可以看出，石韋醇提物的不同極性部位對 5種細菌的影響作用不同，并存在一定的差異，而且同一極性部分對不同種細菌的抑制效果也不同。對 5 種細菌抑菌效果以極性較強的提取物較為突出，正丁醇相和水相對藤黃八疊球菌抑菌較強（見(jiàn)表1），這可能是由于正丁醇相和水相含有活性較高的抑菌成分，化學(xué)成分較為多樣且含量高�？梢�(jiàn), 石韋地上部醇提物不同極性部位抑菌活性因萃取溶劑不同、菌種不同而有所差異, 這是由于不同極性提取物所含化學(xué)成分的類(lèi)別和含量不同所致。這4部分對金黃色葡萄球菌均無(wú)明顯抑菌作用，對大腸桿菌抑制作用較弱，而石油醚相對這5種供試菌均無(wú)明顯抑菌作用。醋酸乙酯相對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑菌作用，正丁醇相對金黃色葡萄球菌也沒(méi)明顯抑菌作用。對照實(shí)驗均無(wú)明顯抑菌環(huán)，地上部醇提物不同極性部位對霉菌均無(wú)明顯抑菌作用。表1  石韋地上部醇提物不同極性部位對 8種菌的抑制作用（略）

　　3.2  最小抑菌濃度比較由表2可知，石韋醇提取物不同極性部位對受試菌的抑菌效果顯示量效關(guān)系。在低濃度時(shí)，無(wú)抑菌活性，抑制環(huán)基本上隨藥液質(zhì)量濃度的增加而提高，抑菌活性漸顯出來(lái)，由此可看出石韋提取物不同極性部位的最小抑菌濃度。只有正丁醇相對大腸桿菌有抑菌效果，對大腸桿菌的最小抑菌濃度為50 mg/ml。醋酸乙酯相、正丁醇相和蒸餾水相對普通變形桿菌的最小抑菌濃度分別為50，25 mg/ml和12.5 mg/ml，這三相對枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為50，25 mg/ml和12.5 mg/ml，對八疊球菌最小抑菌濃度分別為25，25.00，12.5mg/ ml（見(jiàn)表3），可見(jiàn)，水相的最小抑菌質(zhì)量濃度最小，其次是正丁醇。石韋地上部醇提物抗菌具有廣譜性，對 5 種細菌均有不同程度的抑殺活性。表2  醋酸乙酯相、正丁醇相、蒸餾水相的抑菌環(huán)直徑大�。�略）表3  醋酸乙酯相、正丁醇相、蒸餾水相4種細菌的MICmg·ml-1（略）

    本研究結果表明，石韋醇提物4個(gè)極性部位的中強極性部位均含有抑菌活性物質(zhì)，對 5種細菌有一定的抑制作用。由于不同極性部位中化學(xué)成分有明顯差異，不同細菌生長(cháng)所需要的要素和代謝方式不同，所以其活性也有所差異。整體而言，正丁醇相和水相對普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌的抑制效果較好。這些細菌對人體致病力較強，如普通變形桿菌是泌尿系感染最常見(jiàn)的病原菌之一，這種感染具有持久性和難治性［7］。藥用蕨類(lèi)植物的主要活性成分包括生物堿、酚類(lèi)和黃酮類(lèi)［8］。石韋屬植物含綠原酸、芒果苷、異芒果苷、β-谷甾醇、綿馬三萜、槲皮素、異槲皮苷和三葉豆苷等［9］。從以上分析可知，石韋活性物質(zhì)主要集中在中強極性部位，主要的抑菌活性成分存在于正丁醇極性部位和水部分，這可能與生物堿及其鹽類(lèi)、有機酸、萜類(lèi)、黃酮及其苷類(lèi)、甾體等抑菌活性物質(zhì)有關(guān)［10］。綠原酸在高濃度時(shí)對大腸桿菌有明顯的抑菌效用［11］。腹腔注射芒果苷, 可明顯降低糖尿病大鼠由于氧化性損傷引起的糖基化血紅蛋白和血清肌酸磷酸激酶（CPK）的量［12］。應對抑菌效果好的醋酸乙酯相、正丁醇相和水相進(jìn)行分離純化，以便得到抑菌活性較高的化學(xué)成分，并對其抑菌作用方式、作用機理作進(jìn)一步研究。石韋醇提物不同極性部位對黃曲霉、黑曲霉、青霉等霉菌無(wú)明顯抑殺效應。石油醚相對這幾種菌均沒(méi)有明顯抑菌效果，這與莊惠如等［6］研究發(fā)現蕨類(lèi)醇提物的抗真菌活性不如抗細菌，殷帥文等［13］研究幾種蕨類(lèi)植物石油醚相抑菌效果相一致。各種供試藥液對不同細菌的生長(cháng)有不同抑制作用，甚至沒(méi)有抑制作用，說(shuō)明石韋植物里面存在著(zhù)不同溶解性的抑菌物質(zhì)。

   

　　以往多采用單種溶劑提取粗提物進(jìn)行抑菌實(shí)驗［14,15］，這種方法常由于有效成分含量太低或粗提物成分太雜而引起漏篩現象。本研究中，先采用乙醇提取，再濃縮，并用水、石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水依次對提取物進(jìn)行萃取，不僅使植物有效成分得到充分提取，避免漏篩，同時(shí)也為以后的活性成分分離鑒定奠定了基礎。作為藥用資源石韋具有較強的開(kāi)發(fā)價(jià)值，但其抑菌活性具體成分尚不明確，因此，其抑菌活性值得研究。本實(shí)驗為進(jìn)一步研究不同溶劑提取物的具體化學(xué)成分打下基礎，也為今后抑菌成分的進(jìn)一步提取分離指明方向。

作者：李雁群  黎樺  陳超君  覃鋒  王愛(ài)勤  黃榮韶  林偉國  《時(shí)珍國醫國藥》

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