幽門(mén)螺桿菌空泡毒素研究進(jìn)展

【摘要】  幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)是消化道的主要致病因素之一,與多種胃部疾病密切相關(guān),并被認為是胃炎和胃潰瘍產(chǎn)生的病原學(xué)因素�？张荻舅�(Vacuolating cytotoxin, VacA)被認為是Hp的主要毒力因子,在體外可引起真核細胞形成空泡,因此，VacA的研究成為近年來(lái)研究Hp致病機制的新熱點(diǎn),本文對VacA的基因結構、生物學(xué)活性、作用機制等方面的研究作一綜述。

    【關(guān)鍵詞】  VacA；幽門(mén)螺桿菌

 

      幽門(mén)螺桿菌（Hp）是1983年由Marshall和Warren首次分離得到的一種革蘭染色陰性的、螺旋狀、微需氧、主要定居在人胃黏膜、引起人類(lèi)消化道疾病發(fā)生發(fā)展的重要病原菌。幽門(mén)螺桿菌的感染呈全球性分布，其感染率與當地公共衛生狀況有關(guān)，據報道，在西方國家大約30%～50%的成人感染Hp；在中國，其感染率更高，達50%～80%，并有報道指出人群中感染Hp的比例隨年齡增長(cháng)而提高，而且Hp一旦在人胃內定居，如不采取抗菌治療，可以持續幾十年,嚴重危害著(zhù)人群健康。盡管大多數Hp感染者無(wú)癥狀，但有近似10％的感染者患上了胃十二指腸潰瘍，胃癌或黏膜相關(guān)組織（MALT）淋巴瘤。1994年Hp被WHO定為第I類(lèi)致癌因子，而其分泌的蛋白毒素VacA作為單一毒力因子可引起靶細胞空泡化、細胞凋亡、細胞骨架重排，最終導致細胞死亡，因此是Hp重要的毒力因子。僅僅發(fā)現于1983年的Hp現在是研究得最深入的病原體之一,現就近幾年來(lái)研究較多的Hp毒力因子VacA綜述如下。

 

 

    1  VacA蛋白基因結構和基因型

 

    1.1  VacA的基因結構  T.L.Cover于1993年克隆出了VacA的基因，發(fā)現其由3864個(gè)堿基對組成，編碼1287個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)分子量為139kDa，此為VacA的前體分子，包括三個(gè)區域：（1）N-末端為33個(gè)氨基酸殘基組成的前導信號序列；（2）中間區域為成熟的空泡毒素；（3）C-末端為50kDa的多肽，其氨基酸順序與許多G＋細菌的外膜蛋白有同源性。在去掉N末端的信號肽，C末端的類(lèi)似于IgA蛋白酶前體的肽鏈等修飾后，成為成熟的87kDa的VacA。該活性毒素可降解為37kDa及58kDa兩個(gè)亞單位。

 

    VacA可能是具有A-B結構的細菌毒素家族，B亞單位與靶細胞表面的膜受體結合并介導A亞單位進(jìn)入胞漿，A亞單位與細胞內靶分子特異性共價(jià)結合后，導致細胞重要功能的破壞，從而發(fā)揮毒素活性［1］。

 

    從液體培養上清中提純的VacA是一個(gè)分子量大于900kDa的寡聚復合物，完整的VacA分子呈花瓣狀或雪花狀，由6～7個(gè)沿半徑對稱(chēng)的95kDa的VacA單體組成［2］。VacA暴露于酸性pH下可使得寡聚復合物解聚為單體并與VacA細胞毒性的增強有關(guān)。

 

    1.2  VacA的基因型  根據VacA5，末端序列的不同，可分為2個(gè)不同的類(lèi)型：s1(包括s1a,s1b2個(gè)亞型)，s2；根據中間序列的不同又可分為2個(gè)類(lèi)型：m1和m2。這些等位基因理論上產(chǎn)生的重組體除s2/m1外（推測s2/m1型可能是致死性的），經(jīng)證實(shí)都存在。因此，根據VacA序列的不同可將Hp分為s1/m1、s1/m2、 s2/m2。美國的Hp菌株以s1/m1亞型為主，而中國的則以s1/m2亞型占優(yōu)勢［3］。

 

    2  VacA的生物學(xué)活性

 

    2.1  VacA的空泡化作用  VacA誘導細胞空泡形成，這些空泡的膜包含晚期胞內體和晚期溶酶體的標志物［4］�？张莸男纬珊途S持所需的一些細胞內的酶已被證實(shí)，這包括空泡ATP酶［5］和小GTP結合蛋白Rab7［6］Rac1［7］。其中空泡ATP酶能夠調整通過(guò)細胞內間隔膜上的氫離子的流量，因此對于空泡ATP酶的需要提示空泡前體腔內的pH必須是酸性的以便VacA誘導細胞空泡形成。Rab7是調節膜上的離子通道與促進(jìn)溶酶體融合的GTP酶,位于晚期內體膜上,并且是晚期內體的標志物。支持膜沉積及晚期內體之間的同型融合。而Rac1則控制影響膜運輸的細胞骨架成分。即使在檢測不到空泡化的情形下，VacA也能改變晚期吞噬途徑和溶酶體的功能。有研究顯示VacA的空泡化作用受Hp尿素酶的影響，因尿素酶能分解尿素產(chǎn)氨，而氨能促進(jìn)VacA的空泡化作用。

 

    2.2  VacA干擾組織細胞損傷修復機制  VacA能特異地抑制細胞增殖，延緩潰瘍的愈合。最近研究表明VacA參與表皮生長(cháng)因子（EGF）激活的信號轉導通路，Fujiwara等［8］在研究Hp毒素及EGF對胃癌KatoⅢ細胞共同作用的過(guò)程中發(fā)現，不影響細胞活力的VacA毒素劑量可顯著(zhù)抑制EGF與表皮生長(cháng)因子受體（EGFr）的結合，并減少EGF刺激引起的細胞增殖達22%。Pai等［9］用EGF作用于胃癌KATOⅢ細胞后，可以增強EGFr的表達及其自身磷酸化，VacA可以抑制上述過(guò)程。由上可知,VacA干擾了EGF介導的信號轉導通路�？赡苁荲acA與RPTPβ的結合促進(jìn)EGF受體蛋白酪氨酸的去磷酸化，導致EGF作用減弱，因而干擾上皮修復并延遲潰瘍愈合。

 

    2.3  VacA對機體免疫的影響  Molinari等［10］研究了VacA對抗原處理細胞前溶酶體內抗原呈遞過(guò)程的影響，結果表明，VacA可以特異性的抑制由MHC-Ⅱ類(lèi)抗原介導的抗原呈遞過(guò)程，表明VacA可干擾機體保護性免疫而有利于Hp在胃內持續感染，引起相應的臨床癥狀。

 

    2.4  VacA對于細胞功能的其他作用

 

    2.4.1  引起細胞凋亡  VacA能引起線(xiàn)粒體去極化并部分損耗細胞內的ATP，但這在體外試驗中對細胞不是致死的［11］。人類(lèi)的胃細胞對VacA非常敏感，VacA進(jìn)入線(xiàn)粒體伴隨著(zhù)凋亡，這與線(xiàn)粒體釋放細胞色素C和caspase3活化有關(guān)，細胞中毒2天后就有細胞死亡。體內的細胞毒實(shí)驗結果證明還有其他的刺激因素存在，cag＋和表達VacA的Hp株在體內和體外所激發(fā)的胃上皮細胞的凋亡率更高［12］。

 

    2.4.2  引起細胞骨架重排  VacA能影響或與細胞骨架的多種成分相互作用引起肌動(dòng)蛋白重排、Rac-1的改變，而且還能使微管網(wǎng)絡(luò )解體。這些現象與VacA誘導的細胞增生有關(guān)。

 

    2.4.3  其他作用  VacA還能使第二信使產(chǎn)生增加,刺激AGS細胞分泌胃蛋白酶原，增強Hp的侵襲力。不過(guò)這些發(fā)現還有待于進(jìn)一步研究。

 

    3   VacA的作用機制

 

    3.1  VacA結合細胞受體  VacA結合到真核細胞表面是細胞中毒的第一步。3種細胞表面蛋白被認為是VacA的受體：（1）AGS細胞表面的140kDa蛋白；（2）HeLa細胞的EGF受體；（3）RPTPβ。在這3種假定的受體當中，VacA與RPTPβ的相互作用已被證實(shí)。

 

    s1/m1型VacA能引起許多不同細胞的空泡化，因此認為其能有效的結合這些細胞系。相反，s1/m2型VacA也能引起一些細胞系的細胞產(chǎn)生空泡而對另一些則作用甚微。這表明s1/m1型VacA和s1/m2型VacA結合的細胞類(lèi)型不同，因為它們之間的主要區別在于p58的C－末端，提示毒素結合細胞所需的氨基酸序列位于p58內［13］。p58的抗體能抑制VacA結合HeLa細胞，而且GST-p58融合蛋白能結合HeLa細胞。

 

    3.2  VacA－膜相互作用  研究表明［14］活化的VacA能插入脂質(zhì)體膜而未活化的VacA卻不能，此相互作用引起離子和熒光分子的釋放。低pH活化VacA引起疏水端暴露的增加，因為低pH活化與可溶的VacA寡聚體解離為單體有關(guān)，以前隱藏的疏水端的暴露可能涉及到膜的插入。屬于VacAp37的三個(gè)區域在膜插入后變得能抵御蛋白酶的消化，這提示此三個(gè)區域不是插入脂質(zhì)雙層就是轉位到脂質(zhì)體膜腔，大部分p58留在膜外。

 

    3.3  VacA的內化  VacA結合到細胞表面之后慢慢的內化。p58介導的表面受體的結合對于接下來(lái)中毒的步驟來(lái)說(shuō)是遠遠不夠的。事實(shí)上，一個(gè)僅含p58的缺失變異的VacA能結合細胞但不能內吞［15］。因此，在毒素內化過(guò)程中可能存在其他的相互作用，或是由p37N－末端介導的，或是依賴(lài)于VacA的寡聚化［16］。內化是細胞空泡化的必要步驟。

 

    3.4  VacA在細胞內的活性  VacA內化后提示其能在內化位點(diǎn)發(fā)揮毒性作用。為測試這個(gè)假設，HeLa細胞被轉染了編碼VacA的質(zhì)粒，當其在胞質(zhì)中表達時(shí)，VacA誘導的空泡形成與外加的VacA誘導的空泡性質(zhì)一樣［17］。免疫熒光分析顯示細胞內表達的VacA以一種可溶的形式存在于胞質(zhì)和正在空泡化的腔室中。Galmiche等［18］報道表達在HEp－2細胞質(zhì)的全長(cháng)VacA和p34能遷移到線(xiàn)粒體基質(zhì)，而p58卻保留在胞質(zhì)中，這些證據表明VacA進(jìn)入細胞質(zhì)后能進(jìn)一步轉位通過(guò)線(xiàn)粒體膜。

 

    3.5  離子通道的形成  實(shí)驗顯示插入脂質(zhì)雙層的酸活化的VacA能引起通道形成，而此通道是具離子選擇性的。大多數學(xué)者認為通道的形成在VacA誘導典型的空泡形成中起了直接的作用,可能原因是內化的毒素在晚期胞內體間隔上形成陰離子選擇性的通道,對陰離子滲透性的增加會(huì )增加空泡型ATP酶的作用,從而導致CL與具有滲透性的胺鹽在胞內體腔中積聚,進(jìn)而導致胞內體的腫脹與融合,最后形成空泡。抑制實(shí)驗顯示阻礙VacA通道形成的復合物同樣抑制了空泡的形成，而且有效性相同，這充分說(shuō)明了VacA的孔形成活性是其細胞毒性所必需的。Szabo等［19］進(jìn)一步證實(shí)了VacA能增強Hela細胞膜上的離子選擇性通道,并使其去極化。VacA的氨基末端親水區能促進(jìn)毒素的插入，因此缺失了氨基末端的VacA既不能誘導空泡形成也不能形成通道，蛋白分析也顯示p34對于通道的形成起重要作用。

 

    4  VacA的臨床意義

 

    4.1  VacA的臨床相關(guān)性  1989年Figura［20］等比較了從77例胃潰瘍病人和胃炎病人中分離出的Hp菌株的細胞毒素的產(chǎn)生。他們發(fā)現從胃潰瘍病人當中分離出的菌株66.6％能產(chǎn)生細胞毒素，而從胃炎病人中分離出的只有30.1%,這種顯著(zhù)的差異表明細胞毒素可能與胃潰瘍的產(chǎn)生密切相關(guān)。此外，Atherton［21］等發(fā)現了vacAs1基因型與胃潰瘍的重要相關(guān)性。vacAs1基因型與胃癌也具同樣的相關(guān)性。

 

    4.2  VacA作為未來(lái)疫苗的前景  Hp能定居在小鼠的胃內，Ⅰ型菌株的感染可引起與人類(lèi)疾病相似的胃部病變，使用純化的VacA和E.coil不耐熱腸毒素作為佐劑免疫這種小鼠模型可保護其免遭Ⅰ型菌株的感染。說(shuō)明VacA有免疫原性，可作為預防Hp感染的疫苗。

    從Hp培養上清液中高度純化的VacA有生物學(xué)活性，免疫家兔后可誘導家兔產(chǎn)生中和抗體。其血清研究顯示其包含大部分能夠識別構象表位的抗體。說(shuō)明空泡毒素在體內有構象變化,因此針對VacA的免疫應答的建立依賴(lài)于VacA天然的構造，針對重組VacA的抗血清不能中和空泡活性，而且也不能識別天然的VacA，那么對于這種空泡毒素的疫苗只有使用完整的分子才可能有效。但是由于聚集的問(wèn)題，尚未合成有活性的VacA，但是天然的VacA能通過(guò)甲醛脫毒，甲�；�的VacA仍然能夠結合靶細胞，但沒(méi)有空泡活性，盡管其誘導產(chǎn)生的中和抗體與天然未經(jīng)處理的VacA誘導產(chǎn)生的相比有一些改變但仍被成功地應用于保護實(shí)驗當中。

    對于Hp疫苗的各項研究預示，隨著(zhù)對VacA構象（單體分子的聚集）問(wèn)題的解決，VacA很有可能成為預防和治療Hp感染的有效疫苗。

作者：鄭筱雯（綜述），李玉虎（審校）

作者單位：1 330006 江西南昌,南昌大學(xué)醫學(xué)院研究生部

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