沙眼衣原體實(shí)驗診斷技術(shù)進(jìn)展

　1907年，捷克學(xué)者Halberstaeder和Prowazek發(fā)現沙眼包涵體，1956年我國學(xué)者湯飛凡等分離沙眼衣原體成功，引起了全世界對其進(jìn)行廣泛深入的研究［1］。沙眼衣原體(chlamydia trachomatis, Ct)與人類(lèi)疾病關(guān)系密切，且目前已成為許多國家和地區常見(jiàn)的性傳播疾病病原體，日益引起人們重視。Ct感染的診斷決定于病原學(xué)檢查。隨著(zhù)檢測技術(shù)的進(jìn)展，Ct感染的診斷也不斷地發(fā)生變化。我們就此領(lǐng)域的研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)述。

 

　　一、細胞生物學(xué)檢測方法

 

　　1.涂片鏡檢：Ct寄生于柱狀上皮細胞內形成包涵體，取宮頸或尿道標本涂片后，通過(guò)碘染色或姬姆薩染色等可見(jiàn)細胞內包涵體。但由于泌尿生殖道中完整細胞較少，以及細胞內包涵體脆性較大，從而造成敏感性過(guò)低，不推薦用于臨床標本的檢查，僅限于Ct的鑒定［2］。

 

　　2.細胞分離培養法：由于Ct的專(zhuān)性細胞寄生性，一般培養法不能使其生長(cháng)，只有在活的細胞內才能增殖、復制。組織細胞培養法分離Ct多采用McCoy細胞或 Hela-229細胞（國內也有報道采用Hep-2細胞），染色后在顯微鏡下觀(guān)察細胞內有無(wú)包涵體。早期曾試圖用尿標本做培養，但陽(yáng)性率甚低［3］，只能采用尿道或宮頸拭子。培養法的特異性為100%，但敏感性一般低于100%，且各個(gè)實(shí)驗室操作步驟有所不同，沒(méi)有標準化，這可能有助于解釋對同一種非培養方法的不同評價(jià)。組織細胞培養法是診斷Ct感染的“金標準”［4］，但是由于分離培養操作復雜，技術(shù)及設備要求高，所需時(shí)間長(cháng)，且敏感性受標本采集、運送、保存等的影響較大［5］，加上國內很多醫院不具備細胞培養條件，因而不適于臨床應用，多用于科研和疑難病例的終鑒定。

 

　　二、免疫學(xué)檢測方法

 

　　1.直接熒光抗體測定（DFA）：將針對Ct的單克隆抗體用熒光標記，與標本中的Ct結合后，熒光顯微鏡檢查就能見(jiàn)到發(fā)熒光的原體（Ebs）。針對脂多糖（LPS）的抗體熒光不夠亮，且染色不勻；而針對主要外膜蛋白（MOMP）的抗體熒光更亮，且減少非特異染色［6］。DFA不象培養法必須存在有活力的Ct，但其敏感性受人群感染率的影響，且有判定結果帶有主觀(guān)性，熒光易淬滅，不適于檢測大量標本等缺點(diǎn)。多數學(xué)者報道其特異性較高，Hallsworth等［7］報道可達100%，因此在科研中常被用作確證試驗。由于此法操作簡(jiǎn)便、費用低廉，在不具備分子生物學(xué)試驗條件的醫院，可用以檢測臨床標本［8］，但也需經(jīng)驗豐富者操作。

 

　　2.酶免疫測定（EIA）：用酶標記的單克隆或多克隆抗體檢測Ct的LPS或MOMP，酶反應生成有色產(chǎn)物，用酶標儀進(jìn)行測定。目前有Chlamydiazyme、ID-EIA、Pharmacia Chlamydia EIA等多種市售診斷試劑盒可供使用。其敏感性從64%到98%，特異性從93%到98%［9］。通常認為，其敏感性在高危人群中可得到滿(mǎn)意結果，而在新近感染及治療監測中敏感性明顯下降。EIA的優(yōu)點(diǎn)在于方法簡(jiǎn)便、操作自動(dòng)化，適于短時(shí)內大批量標本的檢測。但其最大缺點(diǎn)在于，與其他常見(jiàn)微生物產(chǎn)生交叉反應，如金黃色葡萄球菌、A群及B群鏈球菌、淋病奈瑟菌、醋酸鈣不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌及其他革蘭陰性細菌，從而使特異性達不到100%。國外此法多用于高危人群的篩查，國內應用較少。

 

　　三、分子生物學(xué)檢測方法

 

　　1.直接檢測核酸的技術(shù)（即基因探針技術(shù)）：此技術(shù)利用核酸分子的復性原理，用特定的標記探針去檢測標本中的靶核酸。最初為放射性標記，后來(lái)逐漸發(fā)展為酶或化學(xué)發(fā)光試劑標記。目前有美國圣地亞哥Gen-Probe公司生產(chǎn)的發(fā)光標記基因探針試劑盒PACE-2。與培養法相比，Gen-Probe方法的敏感性和特異性分別為73%～96%和98%～99%［9］，尚無(wú)培養法敏感和特異。由于此法成本高、步驟繁瑣，隨著(zhù)核酸擴增技術(shù)的出現，基因探針技術(shù)也就失去了其應用價(jià)值。

 

　　2.核酸擴增技術(shù)：繼基因探針技術(shù)之后，很快出現了核酸擴增技術(shù)，這些技術(shù)包括（1）靶DNA或RNA的擴增，如聚合酶鏈反應(PCR)，基于轉錄的擴增(TBA)，自動(dòng)維持序列擴增(3SR) 以及鏈置換擴增(SDA)；（2）探針擴增，如連接酶鏈反應(LCR)，Q-β復制酶的擴增；（3）雜交后信號的擴增，如復合探針和分支DNA探針。其中研究和使用較多的是PCR和LCR，尤其是PCR技術(shù)，有學(xué)者認為其將對感染診斷引起革命性變化［10］。

 

　　PCR屬于一種核酸體外擴增技術(shù)，用寡核苷酸指導的DNA合成的重復循環(huán)來(lái)實(shí)現對靶核酸序列的擴增。PCR每個(gè)循環(huán)包含變性、退火、延伸3個(gè)步驟，在不到2小時(shí)內，經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)，在理論上可將最初的靶DNA擴增109倍。最后可用凝膠電泳或探針雜交檢測擴增的DNA。由于先將標本中的核酸特異成分先行擴增復制再行檢出，其敏感性較直接檢測核酸大大提高。

 

　　目前國內外用于構建引物的衣原體DNA有7.5Kb質(zhì)粒、MOMP基因（omp1）和16SrRNA基因。診斷試劑盒AMPLICOR Ct PCR已通過(guò)食品與藥品管理局(FDA)的審批，其擴增靶序列即為質(zhì)粒DNA。許多研究都已表明，PCR較培養法和EIA法都要敏感［7，9，11］，而且PCR對于有癥狀或無(wú)癥狀人群同樣敏感［3］。但基于不同引物的PCR的敏感性仍有所不同。Roosendaal等［12］的研究表明，質(zhì)粒引物PCR最敏感，omp1引物PCR最不敏感，16SrRNA基因引物PCR介于兩者之間。這可解釋為在每個(gè)衣原體細胞中DNA拷貝數不同的緣故。雖然omp1引物PCR敏感性較質(zhì)粒PCR為差，但omp1引物PCR擴增的特異性好，而且Palmer等［13］報道通過(guò)巢式PCR，經(jīng)過(guò)2輪擴增，同樣能夠達到質(zhì)粒引物PCR的敏感性。并且omp1擴增后，利用限制性片段長(cháng)度多態(tài)性（RFLP）還可對Ct進(jìn)行基因分型［14］，這對流行病學(xué)調查具有重要意義。

 

　　PCR技術(shù)不但能檢測尿道或宮頸拭子標本，而且可以采用尿標本進(jìn)行檢測。但尿中可能存在擴增的抑制物，從而影響PCR的敏感性。Verkooyen等［15］報道將標本進(jìn)行預先的加熱處理或使用2SP轉運培養基可顯著(zhù)降低AMPLICOR Ct PCR對抑制因子的易感性。將臨床標本加熱處理后10倍稀釋亦可在很大程度上防止這種抑制。除了尿中的抑制物會(huì )影響PCR的敏感性，導致出現假陰性結果外，PCR的另外一個(gè)缺點(diǎn)是由于其本身技術(shù)原理的原因，容易造成假陽(yáng)性污染。

 

　　近年亦有學(xué)者應用LCR檢測Ct。LCR屬于一種探針擴增技術(shù)，是依賴(lài)靶核酸序列的寡核苷酸探針的連接技術(shù)。Abbott LCR-CT診斷試劑盒也已通過(guò)FDA的審批。同PCR相比，由于使用兩對引物，用LCR檢測Ct感染，具有更高的敏感性和特異性［16］。但連接酶價(jià)格昂貴，難以在臨床普及應用，僅適用于科研，且國內應用較少。

 

　　最新發(fā)展的擴增試驗是Gen-Probe公司的擴增Ct的轉錄介導擴增試驗（TMA），擴增并檢測Ct的rRNA。TMA的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是每個(gè)感染細胞中有大量的rRNA。而且操作步驟簡(jiǎn)便，只是一個(gè)恒溫過(guò)程，不需要變換溫度的擴增儀。Crotchfelt等［17］報道TMA檢測女性尿標本的敏感性和特異性分別為93.8%和100%，男性尿標本為95.6%和98.7%，提示TMA將成為另外一種能利用尿標本檢測Ct的擴增方法。國內尚無(wú)采用該法進(jìn)行檢測的報道。

 

　　目前除了發(fā)展各種核酸擴增技術(shù)，國外學(xué)者們又將眼光投向了標本取材方面的改進(jìn)上。除尿標本外，外陰標本也可能作為一種非侵入性標本而適用于PCR、LCR和TMA等高度敏感的擴增方法，在篩查高危人群中可能會(huì )替代侵入性標本［18］。測試外陰涂片標本可以節省用于尿標本離心的時(shí)間，而且可以由患者自行取材［19］。另外，為節省時(shí)間和費用，有學(xué)者嘗試，同時(shí)進(jìn)行幾種性傳播疾病病原體的共同擴增，但結果不盡如人意［20-22］。

 

　　綜上所述，結合國內情況，泌尿生殖道Ct感染的實(shí)驗診斷中，經(jīng)典的細胞培養方法雖然特異，但耗時(shí)長(cháng)、費用大，且不夠敏感，不適于臨床開(kāi)展；免疫學(xué)方法簡(jiǎn)便快捷，在基層醫院具有實(shí)用性；在具備分子生物學(xué)實(shí)驗條件的醫院，由于PCR方法高度敏感特異，可檢測各發(fā)病率人群，只要嚴格規范操作，避免假陰性及假陽(yáng)性結果的出現，可望在Ct感染診斷中常規使用�？傊�，Ct感染的診斷目前已發(fā)展到分子生物學(xué)水平，隨著(zhù)科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，下個(gè)世紀有可能利用生物芯片等更新的技術(shù)進(jìn)行檢測。我們應密切注視檢測技術(shù)的發(fā)展，以便準確、快速地對Ct感染作出診斷。

 

　　作者：楊婧　張正   中華醫學(xué)檢驗雜志  作者單位：100044 北京醫科大學(xué)人民醫院檢驗科

 

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