金黃色葡萄球菌對萬(wàn)古霉素敏感性試驗方法評價(jià)

摘  要 目的：比較不同方法檢測金黃色葡萄球菌對萬(wàn)古霉素敏感性試驗結果。方法：將1株從臨床標本中分離的異質(zhì)性耐萬(wàn)古霉素的金黃色葡萄球菌（h－VRSA）在含有不同濃度的萬(wàn)古霉素培養基上連續轉種誘導，得到一系列對萬(wàn)古霉素不同程度耐藥的菌株，分別用瓊脂篩選法、微量肉湯稀釋法、E－test法、紙片擴散法和儀器法對萬(wàn)古霉素的敏感性進(jìn)行檢測。結果：瓊脂篩選法、微量肉湯稀釋法和E－test法可以檢測出金黃色葡萄球菌對萬(wàn)古霉素中介耐藥（VISA），而紙片擴散法和儀器法則不能檢出VISA。結論：微量肉湯稀釋法和E－test法是檢測金黃色葡萄球菌對萬(wàn)古霉素敏感性可接受的方法。若以紙片擴散法和儀器法為常規藥敏試驗方法的實(shí)驗室應增加含6μg/ml的萬(wàn)古霉素腦心浸液肉湯進(jìn)行篩選，以加強對VRSA和VISA的監測。

 

 

The evaluation of methods for detecting susceptibility of Staphylococcus aureus to vancomycin

MA Xiao－ling，ZHANG Tao，DAI Yuan－yuan，CHEN Jjian－zhong

 

（Department of Clinical laboratory，Anhui medical university affiliated Anhui Provicial Hospital，Hefei 230001，China）

 

ABSTRACT

 

　　OBJECTIVE：To investigate the effective methods for detecing susceptibility of Staphylococcus aureus to vancomycin.

 

　　METHODS：A isolate of h－VRSA isolated from clinical specimen was inoculated on the increasing concentration of vancomycin agars. Vary degree vancomycin resistant S. aureus were obtained. The susceptibility of these S. aureus to vancomycin were tested by agar screening test，broth microdilution method，E－test，disk diffusion method and automated methods.

 

　　RESULTS：Agar screening test，broth microdilution method and E－test can detect the vancomycin－intermediate S. aureus（VISA），but disk diffusion method and automated methods can not detect VISA.

 

　　CONCLUSION：Broth microdilution method and E－test are acceptable methods for susceptibility testing of S. aureus to vancomycin. Laboratories using automated methods and disk diffusion method as routinely susceptibility test should consider adding a vancomycin agar screen plate to enhance detection of VRSA and VISA.

 

　　Key words：Staphylococcus aureus；vancomycin；resistance；methods

 

　　耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌的出現是臨床抗感染治療中非常棘手的問(wèn)題，為了防范這一嚴重耐藥菌在醫院內迅速傳播，2005年美國臨床和實(shí)驗室標準化研究所（CLSI/NCCLS）[1]的“抗生素敏感性試驗執行標準”中增加了萬(wàn)古霉素耐藥金黃色葡萄球菌（VRSA）和萬(wàn)古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌（VISA）的檢測方法和判斷標準。本文使用體外誘導方法在實(shí)驗室內構建一系列對萬(wàn)古霉素不同程度耐藥的金黃色葡萄球菌菌株，并用于對萬(wàn)古霉素藥敏試驗方法進(jìn)行評價(jià)。

 

　　1. 材料和方法

 

　　1.1 菌株 臨床標本分離的金黃色葡萄球菌，經(jīng)菌譜分析法確定為異質(zhì)性萬(wàn)古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌（h－VRSA），編號為10827[2]。金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC29213、ATCC25923和糞腸球菌標準菌株ATCC51299購于中國藥品生物制品檢定所。

 

　　1.2 藥物 鹽酸萬(wàn)古霉素由美國禮來(lái)公司生產(chǎn)，有效期內使用，使用前用金葡菌標準菌株ATCC29213進(jìn)行質(zhì)控。

 

　　1.3 培養基及藥敏紙片 腦心浸液培養基（BHIA）和萬(wàn)古霉素藥敏紙片由英國Oxoid公司生產(chǎn)，E－test藥敏板條由瑞典AB biodisk公司生產(chǎn)。

 

　　1.4 儀器 Vitek32微生物分析儀（法國，生物梅里埃公司）；Microscan WalkAWay－40微生物分析儀（美國，德靈公司）。

 

　　1.5 方法

 

　　1.5.1誘導方法 將試驗菌株（10827）依次接種于4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml和64μg/ml的萬(wàn)古霉素MH培養基，每一個(gè)濃度傳代3次，不同萬(wàn)古霉素濃度上生長(cháng)的菌落分別命名為10827－4R、10827－8R、10827－16R和10827－32R。

 

　　1.5.2 菌譜分析 取金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 29213和10827及其誘導菌株采用直接菌懸液法配制到0.5麥氏濃度（細菌計數約為108CFU/ml）。以此菌懸液作連續10倍稀釋?zhuān)�取每個(gè)濃度菌懸液100μl，分別劃線(xiàn)接種到含萬(wàn)古霉素0～64μg/ml的梯度BHIA中，35℃孵育48h，進(jìn)行菌落計數，并取菌落數lg對數作菌譜分析圖。

 

　　1.5.3 CLSI/NCCLS推薦的篩選方法[1]將10827及其誘導菌株采用直接菌懸液法配制到0.5麥氏濃度，取10μl接種于含6μg/ml萬(wàn)古霉素的BHIA，接種面積直徑為10～15 mm，35℃孵育，24h觀(guān)察結果，有1個(gè)以上菌落或薄膜狀生長(cháng)判斷為陽(yáng)性，取生長(cháng)的菌落重新鑒定，以保證為純培養的金黃色葡萄球菌，同時(shí)用手工方法檢測細菌的MIC，如MIC＝8～16μg/ml可報告為VISA，MIC≥32μg/ml可報告為VRSA。

 

　　1.5.4 Hiramatsu等[3]報道的篩選方法 菌液的準備和接種方法同1.5.3，篩選平板采用含4μg/ml萬(wàn)古霉素的BHIA。接種菌液量為10μl，35℃孵育，24h內有菌落生長(cháng)，為可疑VISA，24～48h細菌生長(cháng)，為可疑h－VRSA。挑取可疑菌落，進(jìn)一步檢測細菌的MIC以證實(shí)。

 

　　1.5.5 肉湯稀釋法藥敏試驗 按NCCLS M7－A5所提供的方法配制系列萬(wàn)古霉素溶液，萬(wàn)古霉素系列倍比稀釋濃度為0.12～256 μg/ml，每孔加100μl。取金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 29213和10827及其誘導菌株采用直接菌懸液法配制到0.5麥氏濃度，用肉湯將上述菌液進(jìn)行1：100稀釋?zhuān)?06CFU/ml），分別取100μl接種物，加入裝有1ml萬(wàn)古霉素肉湯稀釋液的各支試管和一支不含抗菌藥物的生長(cháng)質(zhì)控管中，混勻，最終菌液濃度為5×105CFU/ml，35℃孵育，24h觀(guān)察結果。

 

　　1.5.6 E－test法[4] 取金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 29213、10827及其誘導菌株采用直接菌懸液法配制到0.5麥氏濃度，均勻涂布接種于BHIA平板，待平板表面干燥，用鑷子將E－test試條放在已經(jīng)接種細菌的平板表面，并使試條全長(cháng)與瓊脂平板緊密接觸，試條MIC刻度面向上，35℃孵育，分別于24h和48h后讀取橢圓形抑菌環(huán)與E試條交界點(diǎn)的抑菌濃度（MIC值），同時(shí)觀(guān)察抑菌環(huán)內有無(wú)菌落出現并對其分純后重新鑒定。

 

　　1.5.7 紙片擴散法 取金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 25923、10827及其誘導菌株采用直接菌懸液法配制到0.5麥氏濃度，用無(wú)菌棉拭蘸取菌液均勻涂布接種于MH平板，待表面干燥，用無(wú)菌鑷子將紙片貼于瓊脂表面并輕壓，使紙片與瓊脂表面完全接觸，35℃孵育，整24h觀(guān)察結果。

 

　　1.5.8 儀器法 采用法國梅里埃公司的Vitek32和美國德靈公司的Microscan WalkAWay－40微生物分析儀分別對ATCC29213、10827及其誘導菌株進(jìn)行藥敏試驗檢測，操作方法按儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，結果由儀器自動(dòng)判斷。

 

　　2. 結果

 

　　2.1菌譜分析 10827為1株臨床分離的金黃色葡萄球菌，表現為異質(zhì)性耐藥，即用肉湯稀釋法檢測MIC為2μg/ml，但在含4μg/ml萬(wàn)古霉素的BHIA上有細菌生長(cháng)，該生長(cháng)菌的MIC為8μg/ml。圖1顯示，隨著(zhù)萬(wàn)古霉素誘導濃度增加、誘導時(shí)間延長(cháng)，曲線(xiàn)上抬、右移，由異質(zhì)性耐藥向同源性中介耐藥和耐藥發(fā)展。

 

　　2.2 藥敏試驗結果 表1所示，瓊脂篩選方法、肉湯稀釋法和E－test法可以有效地檢測金黃色葡萄球菌對萬(wàn)古霉素的敏感性，但儀器法和紙片擴散法，則不能檢測。

　　3. 討論

 

　　不同檢測方法對VISA的檢測結果的差異，可能與以下因素有關(guān)：（1）檢測時(shí)間：Marlowe等[5]發(fā)現VISA與萬(wàn)古霉素敏感的金黃色葡萄球菌（VSSA）比較，生長(cháng)速度明顯減慢，通常在18h內不出現肉眼可見(jiàn)的菌落，需要孵育整24h，甚至48h。而Vitek32對試驗菌株藥敏試驗的平均報告時(shí)間為11h，Microscan WalkAWay－40的平均報告時(shí)間為13h。（2）VISA的易回復性：日本學(xué)者Cui等[6]將16株來(lái)自于世界各國的VISA菌株在不含萬(wàn)古霉素的培養基上連續傳代，發(fā)現VISA易失去對萬(wàn)古霉素的耐藥性，但仍然保留有對萬(wàn)古霉素異質(zhì)性耐藥的亞群。所以Cui等[6]提出h－VRSA可能是細菌在某些抗生素（如萬(wàn)古霉素、β－內酰胺類(lèi)抗生素等）作用下誘導突變的結果，是穩定的；而VISA則可能是h－VRSA在萬(wàn)古霉素壓力下選擇性的結果，是不穩定的，一旦萬(wàn)古霉素選擇性壓力去除，VISA可回復為h－VRSA。（3）培養基的營(yíng)養成分：Cui等[7]發(fā)現，VISA有明顯的營(yíng)養依賴(lài)性，他們認為VISA對萬(wàn)古霉素的耐藥主要依賴(lài)增厚的細胞壁[10]，如果在培養基中加入豐富的細胞壁成分，如氨基酸和葡萄糖后，細菌的耐藥性可以增加。本次試驗表明，使用營(yíng)養成分較高的BHIA檢測效果較好。Cui等[7]報道如果在MH瓊脂中加入20％的馬血清，檢測效果與使用BHIA相同。

 

　　前期的研究證明10827原代為h－VRSA菌株[2]，表1所示，該菌株僅可用含4μg/ml萬(wàn)古霉素BHIA檢出。有關(guān)h－VRSA檢測的意義目前尚有爭論，但越來(lái)越多的學(xué)者[8]認為h－VRSA可能是VISA的前身。Takayama等[9]對1例心內膜炎患者使用萬(wàn)古霉素治療不同時(shí)期分離的5株MRSA菌株進(jìn)行藥敏分析，結果顯示，初次分離的MRSA菌株為h－VRSA，在萬(wàn)古霉素治療過(guò)程中，耐藥性逐漸增加，發(fā)展為VISA，并且最終導致治療失敗。圖1所示，10827菌株在萬(wàn)古霉素選擇性壓力下，耐藥性迅速增加，發(fā)展為VISA/VRSA，所以積極開(kāi)展h－VRSA檢測，對預防和控制VISA/VRSA的產(chǎn)生和傳播有重要意義。

作者：馬筱玲1，張濤2，戴媛媛1，陳建中3（1.安徽醫科大學(xué)附屬省立醫院，安徽合肥 230001；2.蚌埠醫學(xué)院微生物教研室，安徽蚌埠 233003；3.安徽衛生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽合肥 230061）

參考文獻

 

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2. 馬筱玲，王敬華，李華，等. 異質(zhì)性萬(wàn)古霉素耐藥葡萄球菌分離及生物學(xué)特性觀(guān)察．[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2004，24（7）：583－586.

3. Hiramatsu K，Aritaka N，Hanaki H，et al. Dissemination in Japanese hospitals of strains of staphylococcus aureus heterogeneously resistant to vancomycin .Lancet，1997，350（12）：1670－1673.

4. Centers for disease control and prevention. Investigation and control of vancomycin－intermediate and resistant Staphylococcus aureus：A guide for health department and infection control personnel. 2004 （Accessed at http：//www.cdc.gov/ncidod/hip/ARESIST/visa_vrsa_guide.pdf ）

5. Marlowe EM，Cohen MD，Hindler JF，et al. Practical strategies for detecting and confirming vancomycin－intermediate Staphylococcus aureus：a tertiary－care hospital laboratory’s experience，[J]. J Clin Microbiol. 2001，39（7）：2637－2639.

6. Cui LZ，Ma XX，Sato K，et al. Cell wall thickening is a common feature of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus. [J]. J Clin Microbiol，2003，41（1）：5－14.

7. Cui LZ，Murakami H， Kuwahara－Arai K，et al. Contribution of a Thickened Cell Wall and Its Glutamine Nonamidated Component to the Vancomycin Resistance Expressed by Staphylococcus aureus Mu50. [J].Antimicrob Agents Chemother，2000，44（9）：2276－2285.

8. Ruef C. Epidemiology and Clinical Impact of Glycopeptide Resistance in Staphylococcus aureu. [J]. Infection 2004；32（6）：315–327

9. Takayama Y，Hanaki H，Irinoda K，et al. Investigation of methicillin－resistant Staphylococcus aureus showing reduced vancomycin susceptibility isolated from a patient with infective endocarditis.[J]. Int J Antimicrob Agent，2003，22 （6）：567－573.

10. 馬筱玲. 萬(wàn)古霉素敏感性減低的金黃色葡萄球菌.[J]. 中華檢驗醫學(xué)雜志，2004，27（9）：620－622.