耐亞胺培南銅綠假單胞菌CARB-3基因的發(fā)現

　銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）是臨床常見(jiàn)的條件致病菌，由于其固有和獲得性耐藥，使臨床治療成為一大難題。CARB基因編碼產(chǎn)生羧芐西林酶，為β-內酰胺酶Bush分類(lèi)中的2c，在我國CARB基因、流行基因亞型的研究未見(jiàn)報道。我們研究分析了2005年1～12月臨床分離的34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌（IMPRPa），發(fā)現了我院IMPRPa攜帶CARB-3基因，現總結報告如下。

 

 

　　1  材料與方法

　　1.1  菌株來(lái)源與質(zhì)控菌株  34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌來(lái)自于2005年1～12月我院住院病人的臨床分離標本（包括：痰液、尿液、傷口分泌物、膿液、血液等），質(zhì)控菌株包括：銅綠假單胞菌ATCC27853，大腸埃希菌ATCC25922。

 

　　1.2  菌株鑒定及亞胺培南耐藥菌株篩選  試驗菌株經(jīng)BD Phoenix100全自動(dòng)微生物分析儀鑒定到種，采用該儀器配套藥敏試驗復合板篩選亞胺培南耐藥的Pa。

 

　　1.3  主要儀器設備與試劑  Eppendorf centrifuge 5417R 低溫離心機，恒溫金屬�。ê贾荽蠛停�，MJ Peltier Thermal Cycler（MJ Research），Bio-RAD電泳儀，Bio-RAD 凝膠成像系統， 瓊脂糖（OXOID），100bp DNA Ladder Marker（大連寶森），6×Loading buffer（北京天為時(shí)代）。

 

　　1.4  模板DNA提取  采用蛋白酶K消化法。

 

　　1.5  基因擴增  引物序列為：P1：5′-AAA GCA GAT CTT GTG ACC TATTC -3′，P2： 5′-TCA GCG CGA CTG TGA TGT ATA AAC -3′，擴增產(chǎn)物為588bp。熱循環(huán)參數為：93℃預變性3min，93℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 60s，最后一個(gè)72℃ 延伸5min，共循環(huán)35周期。純水為陰性對照。耐藥基因檢測試劑盒由無(wú)錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。

 

　　1.6  結果判斷  取10μl擴增產(chǎn)物與2μl 6×上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠，在100V電壓電泳30min，出現588bp的條帶即為CARB基因陽(yáng)性。用凝膠成像系統觀(guān)察并照相。

 

　　1.7  序列分析  PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工生物工程公司進(jìn)行DNA序列分析，測得序列在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST  中的BLASTn程序進(jìn)行同源性和基因亞型分析。

 

　　2  結果

 

　　2.1  CARB基因PCR檢測結果  34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌共檢出11株CARB基因陽(yáng)性株，檢出率為32.4%，PCR擴增結果見(jiàn)圖1。

 

　　2.2  序列分析結果  任意抽取5株CARB基因陽(yáng)性的PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行單向測序，測得序列與GenBank中注冊號為DQ309773的CARB-3基因完全同源（Identities=100%）。因此我院流行的CARB基因亞型為CARB-3型。

 

　　圖1  部分Pa菌株CARB基因PCR產(chǎn)物電泳圖�。�略）

 

　　3  討論

 

　　CARB基因最早于1981年在Pa中發(fā)現［1］，近年又從不動(dòng)桿菌、弧菌屬、奇異變形桿菌中檢出，已發(fā)現CARB1-9型9個(gè)亞型［2～4］。我院IMPRPa的CARB基因攜帶率為32.4%，提示醫務(wù)工作者應重視和加強Pa的防治和耐藥監測。對CARB基因陽(yáng)性菌株進(jìn)行DNA序列分析，經(jīng)同源性比較，結果顯示：我院流行的CARB基因亞型為CARB-3型。IMPRPa中CARB基因檢出、CARB-3基因亞型發(fā)現為國內首次報道。

 

　　銅綠假單胞菌是臨床常見(jiàn)的條件致病菌，正常情況下不感染人體任何組織，但當人體免疫力下降或嚴重創(chuàng )傷或醫療操作后，Pa幾乎可以感染人體的任何組織，臨床可表現為局部化膿性炎癥和全身性感染，常常危及患者生命。碳青霉烯類(lèi)抗生素（如亞胺培南）因其獨特的抗菌優(yōu)勢，被臨床廣泛用于Pa引起的重癥感染，導致臨床分離株對亞胺培南耐藥性增加。

 

　　Pa對亞胺培南耐藥的機制主要有膜孔蛋白缺失、外排泵和產(chǎn)酶等三種機制［5］。我們對IMPRPa的耐藥機制的相關(guān)研究正在進(jìn)行中。

　　作者：顏英俊　糜祖煌　劉華　楊洋　張凱　楊明清　黃文方　   中華醫學(xué)研究雜志

 

　　【參考文獻】

　　1  Paul G,Joly G ML,Bergogne BE,et al.Novel carbenicillin-lydrolyzing β-lactamases(CARB-5)from Acinetobacter calcoaceticus var.anitratus.FEMS Microbiol Lett，1989,50(1-2):45.

　　2  Alejandro P,Roberto G M,Hector AS,et al.CARB-9 a carbenicillinase encoded in the VCR region of Vibrio cholerae Non-O1,Non-O139belongs to a family of cassette-encoded β-lactamases.Antimicrob Agents Chemother，2004,48(10):4042.

　　3  Nucleotide sequence of the blaRTG-29CARB-5) gene and phylogeny of a new group of carbenicillinases.Antimicrob Agents Chemother，2000,44(4):1070.

　　4  Bert F,Branger C,Lambert-zechovsky N.Comparative activity of beta-lactam agents (carbapenem excepted)against Pseudomonas aeruginosastrains with CARB or OXA beta-lactamASES.Chemotherapy，2004,50(1):31.

　　5  Okamoto K,Gotoh N,Nishino T.Pseudomonas aeruginosa reveals high intrinsic resistance to penem antibiotics:penem resistance mechanisms and their interplay.Antimicrob Agents Chemother,2001,45(7):1964.

　　作者單位：1 610072 四川成都，四川省醫學(xué)科學(xué)院、四川省人民醫院檢驗科2 214026 江蘇無(wú)錫，無(wú)錫市克隆遺傳技術(shù)研究所