酵母樣真菌對抗真菌藥物耐藥性研究進(jìn)展

摘  要

　　自上世紀八十年代以來(lái)，在影響人類(lèi)健康的感染性疾病中，真菌感染在免疫受損的病人群體中發(fā)病率有較大幅度提高，其原因可能與HIV感染、癌癥患者放療和/或化療、器官和骨髓移植、廣譜抗生素的濫用、激素的應用以及靜脈插管和血液透析等介入性操作的增加等因素有關(guān)[1－4]。

　　關(guān)鍵詞：酵母樣真菌；抗真菌藥物；耐藥性

 Advance in study of resistance of yeast－like fungi to antifungal drugs

 

　　Key Words：yeasts，yeast－like fungi，antifungal drugs，resistance

 

　　自上世紀八十年代以來(lái)，在影響人類(lèi)健康的感染性疾病中，真菌感染在免疫受損的病人群體中發(fā)病率有較大幅度提高，其原因可能與HIV感染、癌癥患者放療和/或化療、器官和骨髓移植、廣譜抗生素的濫用、激素的應用以及靜脈插管和血液透析等介入性操作的增加等因素有關(guān)[1～4]。在臨床上，真菌感染率的上升，提高了對抗真菌藥物的使用率，隨之而來(lái)耐藥菌株也不斷增多，給臨床的治療帶來(lái)一定的困難[5，6]。本文簡(jiǎn)要綜述酵母樣真菌對抗真菌藥物耐藥性方面研究進(jìn)展。

 

　　1酵母樣真菌感染流行情況

　　在過(guò)去20年里，酵母樣真菌引起的全身性感染呈上升趨勢。在美國醫院獲得性血流感染中，念珠菌排在第四位。據國外報道每年念珠菌引起的人群發(fā)病率為2/10萬(wàn)～10/10萬(wàn)，念珠菌引起血流感染的死亡率1983～1986年間為38％，1997～2001年間為49％。80％以上HIV陽(yáng)性的患者在整個(gè)疾病過(guò)程中的某個(gè)階段會(huì )出現口腔念珠菌病。盡管念珠菌引起的血流感染中白色念珠菌仍排在第1位，但所占比率有所下降，而非白色念珠菌的感染率有明顯上升，尤其是光滑念珠菌和近平滑念珠菌。不同國家和地區念珠菌菌種分布和流行情況不盡相同。

　　1993年Beck Sague和Jarvis[7]報道美國國家院內感染調查系統院內真菌感染調查結果，真菌感染率從1980年的6％上升至1990年的10.4％，其中念珠菌感染約占80％。Pfaller等[8]報道美國、加拿大和南美洲等34個(gè)醫學(xué)中心1997年1月至12月由念珠菌引起的血流感染國際監測結果，306例念珠菌血癥中，白色念珠菌占53.3％，近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌及其他念珠菌分別占15.7％、15.0％、7.8％、2.0％、0.7％和5.5％。Hajjeh RA等[9]報道1998～2000年間從康涅狄格和巴爾的摩收集了1443株引起血流感染的念珠菌，其中白色念珠菌占45％，光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌等分別占24％、13％、12％和2％，其他念珠菌只占4％。Phillips JR等報道1989年1月至1995年6月在美國某醫院新生兒監護病房獲得性尿道感染中，念珠菌分離率為42％（25/60）。

　　Meis J等[10]報道1997年6月至1998年12月間全球抗真菌監測研究組從臨床收集了20900個(gè)酵母樣真菌，監測數據表明真菌血癥病原菌中第1位為白色念珠菌（69％），第2位為光滑念珠菌（10％），其它念珠菌只占21％，只有少數幾個(gè)國家近平滑念珠菌的比例超過(guò)光滑念珠菌，詳細結果見(jiàn)表1。

　　在法國里昂Martin D等[11]回顧分析了5個(gè)細菌學(xué)實(shí)驗室1998～2001年血培養中念珠菌分離情況，在這段時(shí)間共從190個(gè)病人（共中內科占32％、血液科占23％、外科占23％、重癥監護病房占22％）中分離出198株念珠菌，有8個(gè)病人分離出2株不同菌株。白色念珠菌分離率排第1位，占49.5％，其次為光滑念珠菌和近平滑念珠菌，分別占12.6％、12.1％，克柔念珠菌、熱帶念珠菌和其他念珠菌分別占10.6％、10.1％和5％。內科、外科和重癥監護病房病人血流感染白色念珠菌分離率均排第1位，分別占54.8（40/73）、57.6％（19/33）、68.6％（22/32），而血液科克柔念珠菌分離率排第1位，占34.0％（16/47）。

　　在阿根廷Mujica MT等報道1999－2001年從臨床標本中分離了1006株酵母樣真菌，白色念珠菌占40.3％，非白色念珠菌占54.9％。酵母樣真菌引起的血流感染中近平滑念珠菌占34.9％、白色念珠菌和熱帶念珠菌分別占30.2％和25.6％，光滑念珠菌僅占2.3％。白色念珠菌占皮膚粘膜感染分離菌的60％～80％。酵母樣真菌引起的尿道感染中白色念珠菌占47.7％，光滑念珠菌和熱帶念珠菌分別占24.8％和20.0％。念珠菌引起的甲癬中，近平滑念珠菌（37.7％）取代白色念珠菌（22.0％）排在第1位。

　　關(guān)于非白色念珠菌引起的真菌血癥，Kremery V等進(jìn)行了研究和報道[12]，1991～1998年間在普通病人中35％～65％念珠菌血癥是由非白色念珠菌引起。在腫瘤患者，主要是惡性血液病和骨髓移植病人感染率最高，達40％～70％；但在監護病房和外科病人（35％～55％）、兒童（1％～35％）或HIV陽(yáng)性患者（0％～33％）感染率相對較低。最常見(jiàn)非白色念珠菌是近平滑念珠菌（20％～40％）、熱帶念珠菌（10％～30％）、克柔念珠菌（10％～35％）和光滑念珠菌（5％～40％），葡萄芽念珠菌和季也蒙念珠菌感染率分別為2％～8％和1％～5％，其他非白色念珠菌如：皺折念珠菌、乳酒念珠菌、類(lèi)星念珠菌、挪威念珠菌和無(wú)名念珠菌真菌血癥的感染率低于1％。非白色念珠菌感染引起的死亡率為15％～35％，其中光滑念珠菌感染引起的死亡率最高達40％～70％。

　　在我國，深部真菌感染的發(fā)生率也呈逐漸增高的趨勢。吳紹熙等報道[13]1986年1月1日～12月31日和1996年1月1日～12月31日在全國25個(gè)省、市、自治區40多個(gè)有代表性的單位對臨床或現場(chǎng)確定的致病真菌進(jìn)行了動(dòng)態(tài)研究，就病原菌變遷、各地區動(dòng)態(tài)情況和具體疾病等作了較詳細分析。發(fā)現在1986年占第5位的白色念珠菌到1996年已升至第2位，所占比率亦從1986年的5％上升至19.6％，其他非白色念珠菌所占比率均不同程度上升。余進(jìn)等學(xué)者[14]對北京醫科大學(xué)第一醫院從1998年6月至1999年12月住院和急診留觀(guān)病人不同部位念珠菌培養陽(yáng)性的臨床標本進(jìn)行致病菌種調查。595份念珠菌培養陽(yáng)性的臨床標本，其中白色念珠菌為主要的病原菌，占72.6％（432/595），非白色念珠菌占27.1％（163/595）。非白色念珠菌排前3位的是熱帶念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌，分別占12.1％、5.7％和5.7％。不同部位的念珠菌感染情況：痰培養陽(yáng)性有477份，其中白色念珠菌占78.6％，以下依次為熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌，分別占11.1％、4.4％、3.1％和2.1％。血培養陽(yáng)性只有8份，其中白色念珠菌2株、近平滑念珠菌3株、熱帶念珠菌1株、光滑念珠菌1株和未分類(lèi)念珠菌1株；尿培養陽(yáng)性有71份，白色念珠菌占39.4％，其次為熱帶念珠菌和近平滑念珠菌，各占21.1％，光滑念珠菌占12.7％，克柔念珠菌占2.8％。

　　引起系統性念珠菌感染的危險因素包括年齡、氮質(zhì)血癥、中央靜脈插管、化療、定植、粘膜屏障損傷、器官移植、血液透析、糖尿病、長(cháng)期使用廣譜抗生素、嗜中性白細胞減少癥、腸外營(yíng)養、使用類(lèi)固醇激素及外科手術(shù)等。SENTRY和EIEIO監測發(fā)現隨著(zhù)病人年齡增長(cháng)，白色念珠菌引起的真菌血癥減少，而光滑念珠菌引起的真菌血癥增加。老年人光滑念珠菌和克柔念珠菌比例相應增加。

　　2抗真菌藥物作用機制

　　抗真菌藥物按結構類(lèi)型大致可分為抗生素類(lèi)、嘧啶類(lèi)、烯丙胺類(lèi)、嗎啉類(lèi)、苯胺類(lèi)、硫代氨基甲酸酯類(lèi)、唑類(lèi)（包括咪唑和三唑）等。按其作用機制大致可分為干擾真菌細胞質(zhì)膜，影響細胞DNA或RNA合成、影響真菌細胞壁合成和抑制真菌蛋白質(zhì)合成等幾種類(lèi)型。下面簡(jiǎn)要介紹抗真菌藥物作用機制。

　　2.1干擾真菌細胞質(zhì)膜

麥角甾醇是真菌細胞質(zhì)膜的重要成分，它是一種準平面分子，通過(guò)與磷脂結合穩定磷脂相，從而增加膜的穩定性。麥角甾醇缺乏以及非平面甾醇前體累積會(huì )導致真菌膜的破裂。多烯類(lèi)和唑類(lèi)的抗真菌作用都與損害真菌質(zhì)膜有關(guān)。

　　2.11直接和麥角甾醇結合，影響膜的穩定性

　　多烯類(lèi)抗真菌藥物包括兩性霉素及其衍生物、制霉菌素等。這類(lèi)藥物分子具有親水和疏水兩種特性。其作用機制是藥物進(jìn)入細胞質(zhì)膜直接與麥角甾醇結合，損傷細胞膜，使其形成通道，致使細胞內的重要成分，尤其是鉀離子等外漏，破壞了細胞的正常代謝而抑制其生長(cháng)[15]。

　　2.12影響麥角甾醇合成

　　麥角甾醇的合成是個(gè)復雜的過(guò)程，以乙酰輔酶A起始合成麥角甾醇，經(jīng)過(guò)近20步酶促反應。生物合成麥角甾醇中，抗真菌藥物主要從四個(gè)環(huán)節影響或作用于麥角甾醇的生物合成，即抑制角鯊烯環(huán)氧化酶，抑制C14－去甲基化酶，抑制△14－還原酶和△8→△7異構化酶，抑制C24－甲基轉移酶。

　　2.121抑制角鯊烯轉化為2，3－環(huán)氧角鯊烯所需的角鯊烯環(huán)氧化酶

　　角鯊烯環(huán)氧化酶與質(zhì)膜相結合，需分子O2、NAD（P）H和FAD，它不屬于P－450酶系，在角鯊烯轉化為剛性甾體環(huán)的過(guò)程中起著(zhù)重要作用。烯丙胺類(lèi)、苯胺類(lèi)、硫代氨基甲酸酯類(lèi)都能抑制這一步反應，引起角鯊烯在質(zhì)膜上累積，造成膜的損壞，其代表化合物有萘替芬、特比萘芬、布替萘芬和托萘酯。

　　2.122抑制C14－去甲基化酶

　　麥角甾醇生物合成途徑中，關(guān)鍵酶之一催化羊毛甾醇脫去甾醇環(huán)上14位碳原子的14α－去甲基化酶（簡(jiǎn)稱(chēng)P45014DM）。該酶是所有唑類(lèi)藥物共同作用的靶酶。按化學(xué)結構可將唑類(lèi)藥物分為2類(lèi)，即分子中含有咪唑環(huán)（五員環(huán)中含有2個(gè)氮原子）的咪唑類(lèi)和含有三咪環(huán)（五員環(huán)中含有3個(gè)氮原子）的三唑類(lèi)。咪康唑和酮康唑屬咪唑類(lèi)；氟康唑和伊曲康唑屬于三唑類(lèi)。這些唑類(lèi)藥物作用于P45014DM，阻斷去甲基反應，抑制麥角甾醇的生物合成造成膜麥角甾醇缺乏，14α－甲基甾醇等在膜內蓄積，使細胞膜的結構和功能發(fā)生改變，進(jìn)而使膜的通透性增加和結合在膜上的醇活性異常，使真菌的發(fā)育受到抑制，直至死亡。

　　2.2影響真菌細胞壁合成[16]

　　細胞壁代謝與真菌的生長(cháng)和分裂密切相關(guān)，其作用是控制細胞內膨脹壓力以保持菌體的完整性，其細胞壁的破壞必然導致菌體溶解。大多數真菌細胞壁成分包括幾丁質(zhì)、β－（1，3）－葡聚糖和各種甘露糖蛋白。按作用機制不同，作用于細胞壁的抗真菌藥物可分為β－（1，3）－葡聚糖合成酶抑制劑、幾丁質(zhì)合成酶抑制劑、甘露聚糖－蛋白質(zhì)復合物抑制劑。

　　2.21作用于β－（1，3）－葡聚糖合成酶

　　β－（1，3）－葡聚糖合成酶位于細胞膜，它催化轉運尿苷二磷酸中的葡萄糖基生成β－（1，3）－葡聚糖。β－（1，3）－葡聚糖合成酶為真菌生長(cháng)所必需，抑制該酶可使細胞壁結構異常，導致細胞破裂，細胞內容物滲漏。棘球白素B類(lèi)似物和阜孢霉素類(lèi)似物是兩大類(lèi)β－（1，3）－葡聚糖合成酶非競爭性抑制劑。

　　2.22作用于幾丁質(zhì)合成酶

　　幾丁質(zhì)是β－（1，4）連接的N－乙酰葡萄糖胺的鏈狀聚合物，是細胞壁的支架結構。幾丁質(zhì)合成酶催化N－乙酰葡萄糖胺的聚合，在真菌的細胞分裂和成熟中起了重要作用。真菌體內有3種幾丁質(zhì)合成酶：Chs1、Chs2和Chs3。其中Chs1是修復酶，不是必需的，而Chs2和Chs3非常重要。多氧菌素D和尼可霉素Z和X是兩類(lèi)幾丁質(zhì)合成酶抑制劑，其中以尼可霉素Z和X研究得較為深入。尼可霉素Z和X的結構與幾丁質(zhì)合成酶的底物UDP－N－乙酰葡糖胺類(lèi)似，因而可競爭性地抑制幾丁質(zhì)合成酶。但這類(lèi)藥物的抗菌譜相對較窄。經(jīng)研究證實(shí)，尼可霉素與氮唑類(lèi)藥物（氟康唑、伊曲康唑）聯(lián)合應用會(huì )大大提高療效。目前又篩選出一個(gè)新型的幾丁質(zhì)合成酶抑制劑arthrichitin。此抑制劑克服了尼可霉素抗菌譜窄的缺點(diǎn)，對念珠菌、隱球菌等具有廣譜活性。

　　2.23作用于甘露聚糖和甘露聚糖－蛋白質(zhì)復合物

　　甘露聚糖和甘露聚糖－蛋白質(zhì)復合物是真菌細胞壁的中、外層結構。普那米星和benamomicin類(lèi)藥物通過(guò)Ca2+選擇性地與真菌細胞壁上的甘露聚糖和甘露聚糖－蛋白質(zhì)復合物橋連，使甘露聚糖的空間結構發(fā)生改變，從而引起細胞壁破裂，細胞膜通透性增加，導致細胞死亡。

　　2.3抑制真菌蛋白質(zhì)合成

　　2.31抑制真菌延長(cháng)因子

　　延長(cháng)因子（elongation factor，EF）是真菌和哺乳動(dòng)物細胞中蛋白質(zhì)的生物合成所必需的。延長(cháng)因子有3種，EF1和EF2為真菌和哺乳動(dòng)物所共有，EF3為真菌特有，并且真菌和哺乳動(dòng)物細胞中的EF1和EF2結構差異很大。因此，EF是抗真菌藥物設計中的重要靶點(diǎn)。糞殼菌素（sordarin）及其衍生物是選擇性的EF2抑制劑，它作用于蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程。對EF3抑制劑的研究相對較少，目前還沒(méi)有發(fā)現選擇性作用于EF3的化合物。由于EF3為真菌所特有，這提示選擇性EF3抑制劑可能是一類(lèi)很有潛力的廣譜抗真菌藥物。

　　2.32抑制N－肉豆蔻�；�轉移酶

　　在白色念珠菌、新型隱球菌和其他一些真菌中，N－肉豆蔻�；�轉移酶催化將N－肉豆蔻�；鶑腃oA轉移至蛋白質(zhì)氨基酸末端的反應是必需的。因此，N－肉豆蔻�；�轉移酶抑制劑可抑制某些真菌蛋白質(zhì)的生物合成。

　　2.4影響DNA、RNA合成

　　5－氟胞嘧啶（5－FC）是目前臨床比較常用的作用于核酸合成的抗真菌藥物。其在滲透酶的幫助下進(jìn)入真菌細胞，一旦進(jìn)入胞內，則通過(guò)胞嘧啶脫氨酶轉化成為5－氟尿嘧啶（5－FU）。隨之，通過(guò)鳥(niǎo)苷酸（UMP）－焦磷酸酶轉化為5－氟鳥(niǎo)苷酸（FUMP），其進(jìn)一步被磷酸化后摻入到RNA中，最終破壞蛋白質(zhì)的合成。5－FU也能夠被轉化為5－氟脫氧鳥(niǎo)嘧啶單磷酸，其能夠抑制參與DNA合成和細胞核分裂的腺苷酸合成酶。因此，5－FC的抗菌作用機制涉及到干擾嘧啶的代謝、RNA和DNA的合成以及蛋白質(zhì)的合成等。

　　灰黃霉素也是早期的抗真菌藥物，因其結構與鳥(niǎo)嘌呤類(lèi)似，競爭性抑制鳥(niǎo)嘌呤進(jìn)入DNA分子，影響DNA合成。該化合物也可抑制哺乳動(dòng)物細胞DNA合成，故毒性大，現已不常用。

　　3．酵母樣真菌對抗真菌藥物耐藥機制

　　近十年來(lái)針對真菌耐藥機制開(kāi)展了多項研究，其中研究較多且較清楚的是酵母樣真菌尤其是念珠菌對唑類(lèi)藥物的耐藥機制。真菌耐藥與細菌有相似之處，可分為固有（或內在）耐藥和獲得性耐藥，常見(jiàn)對唑類(lèi)藥物固有耐藥的念珠菌有克柔念珠菌和光滑念珠菌。約10％臨床分離的白色念珠菌對5－FC存在固有耐藥，30％菌株暴露于5－FC后可發(fā)展為獲得性耐藥。葡萄芽念珠菌對兩性霉素B也存在固有耐藥。酵母樣真菌耐藥機制主要有：（1）藥物的靶酶產(chǎn)生增多或靶酶結構改變使得藥物對其親和力減低；（2） 真菌細胞內藥物累積減少；（3）代謝途徑改變；（4）生物被膜形成。對某一耐藥菌株而言，各種機制既可以單獨起作用，又可以?xún)煞N或多種機制同時(shí)作用。通常來(lái)講，參與耐藥的機制越多，耐藥程度越重。以下簡(jiǎn)述酵母樣真菌耐藥機制的研究現狀。

　　3.1對唑類(lèi)藥物的耐藥機制

　　唑類(lèi)抗真菌藥物是目前臨床上主要的治療真菌感染藥物，現在臨床上使用的該類(lèi)藥物包括：咪唑類(lèi)藥物酮康唑、克霉唑、益康唑、咪康唑和聯(lián)苯芐唑等；三唑類(lèi)藥物氟康唑、伊曲康唑和特康唑等。迄今為止，多數學(xué)者認為念珠菌對唑類(lèi)藥物的耐藥機制主要涉及以下幾個(gè)方面。

　　3.11藥物作用靶位改變14α－z去甲基化酶（P45014DM）是唑類(lèi)藥物的靶向酶。P45014DM結構改變與過(guò)度表達均可導致念珠菌對此類(lèi)藥物耐藥。與藥物作用靶位改變相關(guān)的耐藥機制主要有以下幾個(gè)方面。

　　3.111靶酶基因突變

　　靶酶基因Erg11（以前稱(chēng)為CYP51）編碼區發(fā)生改變，可引起酶三維結構和活性發(fā)生改變，導致酶與藥物的親和力減低而產(chǎn)生耐藥。Asai等[17]研究發(fā)現白色念珠菌的P45014DM對唑類(lèi)藥物敏感性下降，但酶本身的催化活力并無(wú)顯著(zhù)改變。測序分析比較發(fā)現，耐藥株靶酶基因Erg11編碼區出現12個(gè)堿基的點(diǎn)突變，導致基因產(chǎn)物4個(gè)氨基酸改變。其中7個(gè)堿基突變可能與耐藥株靶酶與底物的親和力下降有關(guān)。每個(gè)耐藥株靶酶基因Erg11編碼區突變點(diǎn)位置和數量不完全相同。

　　3.112靶酶基因過(guò)度表達

　　靶酶基因調控區和/或相應的調節基因發(fā)生改變，靶酶基因過(guò)度表達，細胞內藥物不能完全抑制靶酶的活性而耐藥。Marichal等[18]發(fā)現光滑念珠菌對唑類(lèi)藥物耐藥株Erg11基因拷貝數比敏感株多3.7倍，Erg11 mRNA水平比敏感株高8倍。光滑念珠菌Erg11基因過(guò)度表達，可由體內、外藥物誘導所致。

　　3.12真菌細胞內藥物累積減少

　　真菌細胞內藥物累積減少是真菌產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)重要機制。一方面是因為膜通透性降低使進(jìn)入的藥物減少；另一方面細胞內的藥物外排增強，近來(lái)研究表明，藥物外排增強為其主要原因。

　　3.121細胞膜通透性降低

　　Ryley等最早報告由于細胞膜通透性降低，而使進(jìn)入細胞內藥物減少引起唑類(lèi)藥物耐藥。耐藥菌株對唑類(lèi)藥物的透過(guò)性發(fā)生改變，系因細胞膜上磷脂及甾醇組成均發(fā)生變化，從而影響到細胞膜的流動(dòng)性，繼而影響到通透性。Hazel等學(xué)者在對釀酒酵母菌的多藥耐藥基因篩選研究中發(fā)現PDR（pleiotropic drug resistance）16和PDR17基因與細胞通透性相關(guān)。PDR16和PDR17基因主要調控細胞內脂質(zhì)合成和脂質(zhì)轉運，改變細胞膜上脂質(zhì)組成，繼而影響細胞膜的通透性，阻礙藥物進(jìn)入細胞體內。PDR16基因缺損，極大地改變了細胞膜上甾醇的組成，使釀酒酵母菌對咪康唑和酮康唑的敏感性提高了10～20倍；PDR17基因缺損改變了細胞膜上磷脂的組成和比例，但不影響咪康唑和酮康唑的敏感性；PDR16和PDR17基因同時(shí)缺損，可以使咪康唑和酮康唑的敏感性提高50～100倍。

　　3.122藥物外排

　　真菌細胞對藥物外排致耐藥，是通過(guò)細胞膜上依賴(lài)能量的藥物外排泵的主動(dòng)轉運，使細胞內藥物濃度降低所致。該藥物外排泵為多藥耐藥（multi－drug resistance， MDR）相關(guān)蛋白質(zhì)。MDR蛋白有多種，根據其功能不同，可將其分為兩大類(lèi)。

　　3.1221ATP結合轉運蛋白（ATP binding cassette transporters， ABCT）

　　ABCT是ATP能量依賴(lài)型多藥轉運載體，是細胞膜上的外排機能泵。研究表明，與白色念珠菌的MDR有關(guān)的ABCT轉運載體編碼基因CDR（Candida drug resistance）家族中，除CDR1以外，至少還存在9個(gè)以上，其中5個(gè)（CDR1，CDR2、CDR3、CDR4、CDR5）與唑類(lèi)藥物耐藥性有關(guān)。目前認為CDR針對的主要是脂溶性分子。CDR1為白色念珠菌中最先發(fā)現的外排泵基因，大多數氟康唑耐藥的白色念珠菌株中，都發(fā)現CDR1超表達，對咪唑藥物都呈耐藥性。CDR1缺損或突變株對咪唑類(lèi)藥物以及特比萘芬、阿莫羅芬等其他抗真菌藥物和抗代謝藥物高度敏感。CDR1基因表達產(chǎn)物為Cdr1p，具有ABCT載體蛋白的共性，是一種膜蛋白。整個(gè)蛋白有4個(gè)區，其中2個(gè)區為疏水區，為穿膜部分，另2個(gè)區推測為與ATP結合區。

　　Sanglard等研究發(fā)現CDR2超表達株顯示對唑類(lèi)藥物特比萘芬和阿莫羅芬耐藥。但CDR2單獨破壞株并未顯示對唑類(lèi)藥物高度敏感，而CDR1和CDR2同時(shí)破壞株顯示對唑類(lèi)藥物高度敏感。臨床分離的耐藥株中，發(fā)現CDR1和CDR2都超表達。推測存在有這2個(gè)基因的共同激活因子。

　　3.1222易化擴散載體超家族（major facilitator superfamily， MFS）

　　這是一種通過(guò)電化學(xué)勢能進(jìn)行被動(dòng)轉運的MDR蛋白，屬于非能量依賴(lài)型載體。在這個(gè)家族中由MDR1編碼的Mdr1p是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一，目前認為MDR主要針對水溶性分子。Wirsching等[19]對一臨床分離的MDR1基因過(guò)度表達的氟康唑耐藥株進(jìn)行研究，通過(guò)MDR1基因敲除發(fā)現，MDR1基因過(guò)度表達與氟康唑耐藥有關(guān)，但與酮康唑無(wú)關(guān)，Mdr1p底物具有一定的特異性。Mdr1p可摻在細胞膜上占領(lǐng)特定的位點(diǎn)，發(fā)揮抑制藥物攝入的作用。由于MDR1的表達受限，并且Mdr1p也只能占領(lǐng)細胞膜上的特定位點(diǎn)，因此，Mdr1p對藥物攝入的抑制作用有一定限度，在耐藥菌株中，仍有部分藥物被攝入細胞內。

　　Cdr1p、Cdr2p與Mdr1p等均屬MDR蛋白，近年來(lái)對真菌耐藥性的研究多集中在這些蛋白上。Cdr1p、Cdr2p通過(guò)增加藥物的外排，而Mdr1p通過(guò)抑制藥物攝入降低細胞內藥物濃度。

　　3.13代謝途徑的改變

　　唑類(lèi)藥物通過(guò)抑制14α－去甲基化酶的活性，羊毛甾醇不能轉換為14去甲基羊毛甾醇，從而阻斷麥角甾醇的合成。羊毛甾醇在14還原酶的催化下生成14α－甲基類(lèi)固醇，后者在由ERG3基因編碼的△5，6去飽和酶催化下生成14α－甲基3，6－二醇。缺乏麥角甾醇和14α－甲基3，6－二醇的堆積抑制了真菌的生長(cháng)。部分真菌由于ERG3基因的突變，不能產(chǎn)生有活性的△5，6去飽和酶，致使在細胞內累積的是14α－甲基類(lèi)固醇而不是14α－甲基3，6－二醇，而14α－甲基類(lèi)固醇能部分替代麥角甾醇的功能，維持真菌細胞生長(cháng)，從而對唑類(lèi)耐藥。

　　3.14生物被膜形成

　　生物被膜是指微生物分泌于細胞外的多糖蛋白復合物，將自身包裹其中于生物表面形成的膜狀物。膜內菌細胞的形態(tài)常與浮游菌不同，且對藥物的敏感性差[20]。研究表明，許多念珠菌感染與念珠菌在內置醫療材料如靜脈導管、尿道插管及人工合成瓣膜上所形成的生物被膜有關(guān)，且這些膜內真菌常表現出高度的耐藥性。其耐藥機制可能與下列因素有關(guān)：（1）膜內真菌生長(cháng)速率慢；（2）胞外聚合物基質(zhì)所形成的膜屏障作用；（3）表面誘導性耐藥基因的表達。

　　3.2對兩性霉素B耐藥機制[21，22]

　　兩性霉素B（Amphotericin B，AmB）屬于多烯類(lèi)抗真菌藥物，其分子結構與膜磷脂相似，同時(shí)具有疏水基和親水基，正是這種兩歧性（amphipathic），使AmB通過(guò)真菌細胞壁時(shí)能與胞膜發(fā)生作用。AmB的作用機制就在于能與真菌細胞膜上的麥角甾醇、磷脂結合形成穩定復合物，在膜上形成微孔，改變膜的通透性，導致細胞內鉀離子、氨基酸、核苷酸等重要物質(zhì)外漏，從而破壞細胞正常代謝，抑制其生長(cháng)。對兩性霉素B耐藥推測為細胞中甾醇的量和/或質(zhì)發(fā)生改變引起，細胞膜上主要甾醇成分已不是麥角甾醇，而被其它甾醇所代替和/或細胞膜上總麥角甾醇量減低，這些變化可能與ERG2或ERG3基因突變有關(guān)。唑類(lèi)抗真菌藥物能抑制細胞膜上麥角甾醇的生物合成，導致細胞膜中缺乏AmB結合位點(diǎn)，使真菌對AmB產(chǎn)生耐藥性。提示，氟康唑與AmB不宜聯(lián)合應用。

　　3.3對氟胞嘧啶耐藥機制[21，22]

　　真菌對5－FC產(chǎn)生耐藥性的主要機制是由于降低了藥物的吸收（即失去了滲透酶的活性），或是當真菌由于缺少胞嘧啶脫氨酶或尿嘧啶磷酸核糖基轉移酶時(shí)，使5－FC不能轉化為5－氟鳥(niǎo)苷酸（FUMP）。

　　對5－FC固有耐藥是較普通的表型，據估計約10％臨床分離的白色念珠菌是固有耐藥，而約30％菌株可進(jìn)一步發(fā)展為獲得性耐藥。有學(xué)者研究了念珠菌對5－FC耐藥的的遺傳特性，對5－FC耐藥是隱性遺傳，決定念珠菌對5－FC耐藥的等位基因有3型：第1型為FCY/FCY純合子，該等位基因決定念珠菌對5－FC敏感；第2型為fcy/fcy純合子，該等位基因決定念珠菌對5－FC完全耐藥；第3型為fcy/FCY雜合子，該等位基因決定念珠菌對5－FC輕度耐藥，純合子（fcy/fcy）耐藥表型可由雜合子（FCY/fcy）進(jìn)一步突變或有絲分裂重組產(chǎn)生。對5－FC固有耐藥通常是胞嘧啶脫氨酶缺失的結果。在白色念珠菌中對5－FC獲得性耐藥主要是由于尿嘧啶磷酸核糖基轉移酶（UPRTase）活性減低引起。含FCY/FCY純合子菌株具有高UPRTase活性（大約3U），含FCY/fcy雜合子菌株具有低的UPRTase活性（約1.5U），而具有fcy/fcy純合子的菌株幾乎檢測不出UPRTase活性。在單倍體新型隱球菌中基因突變最可能引起5－FC耐藥。遺傳分析表明有兩個(gè)遺傳位點(diǎn)FCY1和FCY2，FCY2和FCY1突變可產(chǎn)生5－FC耐藥。

　　總之，真菌耐藥機制十分復雜。菌株呈高度耐藥可能是多種耐藥機制共同作用的結果。Perea等對耐藥白色念珠菌的流行病學(xué)調查發(fā)現：85％的耐藥株為外排泵過(guò)度表達；65％和35％的耐藥株為藥物靶酶改變或過(guò)度表達；75％的耐藥株為多因素聯(lián)合耐藥。

　　4酵母樣真菌對抗真菌藥物耐藥性

　　新的抗真菌藥物在免疫力低下病人廣泛和長(cháng)期應用，使得獲得性耐藥菌株越來(lái)越多，在臨床上念珠菌對唑類(lèi)藥物的耐藥最常見(jiàn)，成為真菌病治療的一大難題。許多學(xué)者對此進(jìn)行了深入研究和報道。但不同國家和地區耐藥狀況有所不同，不同菌種對不同的藥物耐藥率也存在較大差異。

　　美國學(xué)者Ostrosky－Zeichner等[24]對分離于血流中的2000株念珠菌進(jìn)行了抗真菌敏感性調查，結果表明：除克柔念珠菌和熱帶念珠菌外，大于95％菌株對5－FC敏感，分別有12％和6％克柔念珠菌和熱帶念珠菌對5－FC耐藥；對兩性霉素B耐藥菌株較罕見(jiàn)，僅2％～3％近平滑念珠菌和克柔念珠菌對其耐藥；克柔念珠菌和光滑念珠菌對氟康唑和伊曲康唑存在較高耐藥性，兩種菌對氟康唑耐藥率低于10％，而對伊曲康唑耐藥率則達18％。Messer等進(jìn)行的大型調查研究結果表明1997年至2003年臨床分離的念珠菌對唑類(lèi)抗真菌藥物的敏感性變化較小，白色念珠菌、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌對伏立康唑、ravuconazole、氟康唑等仍具有較高敏感性（≤1.3％耐藥），光滑念珠菌對唑類(lèi)藥物耐藥率小于20％。值得注意的是拉丁美洲分離的光滑念珠菌對ravuconazole和兩性霉素B耐藥率分別達到33％和27％，高于南美洲國家的17％和13％。

　　Hajjeh等[9]報道1998～2000年間從康涅狄格和巴爾的摩收集了1443株引起血流感染的念珠菌，其中白色念珠菌對氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶耐藥率分別為1.2％、0.9％和4.3％；光滑念珠菌對上述3種藥物的耐藥率分別為7.1％、19.5％和0；熱帶念珠菌分別為6％、6％和<1％；克柔念珠菌分別為35％、25％和5％；近平滑念珠菌對氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶耐藥率較低，分別為0、<1％和<1％。Meis等[10]報道1997年6月至1998年12月間全球抗真菌監測研究組從臨床收集了20900個(gè)酵母樣真菌，其中常見(jiàn)菌株白色念珠菌14368株、光滑念珠菌2073株、熱帶念珠菌869株、近平滑念珠菌752株、克柔念珠菌351株、新型隱球菌284株，這些菌種對氟康唑的耐藥率分別為0.8％、13.2％、3.9％、2.5％、34.8％和5.6％。Pafller等測定了5－氟胞嘧啶對1992年至2001年從世界200多個(gè)醫學(xué)中心收集的8803株念珠菌的體外抗菌活性，5－FC對念珠菌有較好的抗菌活性，MIC90≤1μg/ml，平均只有3％分離菌株對5－FC耐藥，但克柔念珠菌耐藥率相對較高，達28％。

　　法國Newman等1994年報道Pasteur醫院和其他幾個(gè)研究中心分離自艾滋病患者的念珠菌中有10％對氟康唑耐藥。在土爾其從臨床腫瘤患者標本分離的56株白色念珠菌中，有12.5％、10.7％和5.3％菌株分別對氟康唑、酮康唑和氟胞嘧啶耐藥；14.3％（1/7）近平滑念珠菌對氟康唑耐藥。在意大利，Testore等2004年報道從臨床標本中分離的1565株念珠菌中，有4.7％菌株對氟康唑耐藥。Cuenca－Estrella等[23]報道1996年至1999年從西班牙和阿根廷99個(gè)醫學(xué)中心血流感染標本中分離出744株念珠菌，有97.5％菌株兩性霉素B MIC≤1μg/ml；有8.3％菌株對氟胞嘧啶敏感性減低；分別有9.9％和21.9％菌株對氟康唑和伊曲康唑敏感性減低。

　　國內孫長(cháng)貴等[25]研究了2001年至2003年從臨床標本中分離的226株念珠菌對氟康唑、伊曲康唑、兩性霉素B和氟胞嘧啶等四種抗真菌藥物體外敏感性，結果表明：226株受試菌對氟胞嘧啶和兩性霉素B敏感性最高，16株近平滑念珠菌對四種藥物均敏感，最常見(jiàn)的白色念珠菌對氟康唑、伊曲康唑和兩性霉素B的耐藥率分別為9.5％、7.7％和8.3％，熱帶念珠菌對氟康唑和伊曲康唑耐藥率分別為3.2％和6.5％，而光滑念珠菌對氟康唑和伊曲康唑耐藥率分別達18.2％和27.2％。

　　張建平等[26]報道2001年4月至2002年12月間從臨床標本中分離的359株酵母樣真菌對10種抗真菌藥物敏感性研究，結果顯示：其總體耐藥率（不包括中介菌株）最高的抗真菌藥物依次為灰黃霉素90.25％、氟康唑52.65％、伊曲康唑45.13％、咪康唑29.53％、益康唑28.13％。白色念珠菌對氟康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶和兩性霉素B等藥物耐藥率分別為54.96％、50.90％、9.46％和0.00；熱帶念珠菌、光滑念珠菌及克柔念珠菌對上述四種藥物耐藥率分別為42.86％、36.74％、4.08％和0.00，44.45％、28.57％、3.17％和4.76％，50.00％、30.00％、20.00％和10.00％。

　　臺灣省Yang等[27]報道2002年分離的909株念珠菌對兩性霉素B和氟康唑的耐藥性，有2.5％菌株對兩性霉素B耐藥，比1999年的0.5％提高了5倍；而對氟康唑耐藥率為1.9％，與1999年（8.4％）相比是下降的。

　　在非白色念珠菌中，Krcmery等[12]報道對氟康唑耐藥率：克柔念珠菌75％、光滑念珠菌35％、熱帶念珠菌和葡萄芽念珠菌是10％～25％；對兩性霉素B耐藥率：葡萄芽念珠菌和皺折念珠菌為5％～20％、克柔念珠菌為10％～15％、季也蒙念珠菌為5％～10％。

　　念珠菌對唑類(lèi)藥物存在交叉耐藥性，可能與CDR基因過(guò)度表達和/或ERG11基因點(diǎn)突變等有關(guān)。

　　對氟康唑耐藥的白色念珠菌中，約10％～20％菌株同時(shí)也對伊曲康唑耐藥。

　　5結　束　語(yǔ)

酵母樣真菌感染率的提高和耐藥率的上升，給臨床抗感染治療帶來(lái)嚴峻挑戰；而真菌耐藥機制的復雜性，又增加了對感染控制的難度。臨床及微生物學(xué)實(shí)驗室應建立抗真菌藥物敏感性試驗方法，加強對酵母樣真菌耐藥性的監測及耐藥機制的研究，為臨床抗真菌感染治療方案的的制定提供實(shí)驗室依據。臨床醫師應根據實(shí)驗室提供的藥物敏感性試驗結果，正確合理選用藥物。制藥專(zhuān)家應根據目前對真菌耐藥機制研究的最新成果及真菌的特點(diǎn)，積極研究開(kāi)發(fā)更多新的產(chǎn)品應用于臨床。

作者；孫長(cháng)貴，曾賢銘，楊燕（解放軍第一一七醫院檢驗科南京軍區醫學(xué)檢驗質(zhì)控中心，杭州310013）

 

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