傷寒桿菌O抗與H抗血清的制備及其應用

在微生物實(shí)驗課教學(xué)中,肥大反應(widal stest)被列為本科臨床專(zhuān)業(yè)學(xué)生實(shí)驗的必修內容之一。近年來(lái),由于抗生素的早期應用,臨床隨機采集的患者血清標本抗體含量很低,實(shí)驗中很難出現典型的抗原抗體凝集現象,由于實(shí)驗要用到抗血清,而抗血清又難以買(mǎi)到,價(jià)格也昂貴,為了節約經(jīng)費，使用方便，我們嘗試了自制抗血清，并且在實(shí)驗教學(xué)中，通過(guò)制備抗血清進(jìn)行抗原抗體之間免疫學(xué)反應，使學(xué)生獲得有關(guān)抗原、抗體、抗原抗體間的免疫反應這些抽象的免疫學(xué)的基本知識，使教學(xué)獲得了較好的效果。

 

　　1  材料與方法

 

　　1.1  動(dòng)物的選擇  實(shí)驗動(dòng)物為家兔，體重1.5 kg/只~2.0 kg/只。

 

　　1.2  抗原的制備傷寒桿菌的抗原制備  采用北京生物制品鑒定所提供的國內標準菌株傷寒桿菌“O”接種在普通瓊脂平板上約20只～30只，置37 ℃培養18 h～24 h，取培養物作涂片，并行革蘭染色，經(jīng)顯微鏡觀(guān)察應均為革蘭陰性桿菌的純培養物，并作生化鑒定，葡萄糖(+)、乳糖(-)、靛基質(zhì)(-)、尿素(-)、動(dòng)力(+)，并用傷寒診斷血清“O”作玻片凝集，出現顆粒凝集確診為傷寒桿菌“O”抗原,如有污染雜菌的平板應棄去，而純培養的平板加5 ml～6 ml無(wú)菌生理鹽水，用L型玻棒刮下菌苔，離心沉淀（2 500轉/min，10 min），同法用無(wú)菌生理鹽水洗滌兩次，棄上清，取沉淀物加適量滅菌生理鹽水配成30億/ml的菌液［1］，并按菌量加入0.3%～0.5%甲醛作防腐，置37 ℃作用30 min進(jìn)行殺菌處理，即為傷寒桿菌“O”菌液，置4 ℃冰箱備用。傷寒桿菌“H”菌液的制備［1］，方法同傷寒桿菌“O” 抗原制備，此菌株也來(lái)自北京生物制品鑒定所。

 

　　1.3  免疫動(dòng)物的方法［2］  實(shí)驗動(dòng)物為家兔，共12只，分別注射傷寒桿菌“O”、“H”菌液各6只，程序見(jiàn)表1。表1：免疫注射程序日期（略）    

 

　　2  結果與保存

　　

　　2.1  抗血清效價(jià)測定與保存  于末次免疫1周后在耳緣靜脈采血2 ml分離血清，抗血清效價(jià)測定采用試管凝集法（肥大反應），用生理鹽水作血清稀釋液，倍比依次稀釋血清，置37 ℃ 24 h后觀(guān)察結果，以呈現++凝集的血清最高稀釋倍數作為血清凝集的效價(jià)。達到理想的抗體效價(jià)后采用心臟采血收集血清分裝成小瓶，每瓶約3 ml~5 ml，做好標記，置-20 ℃冰箱保存。

 

　　2.2  試管凝集實(shí)驗  將10個(gè)潔凈凝集試管，依次加0.5 ml生理鹽水,取1∶400稀釋的傷寒桿菌抗血清0.5 ml(血清稀釋視抗血清效價(jià)而定,效價(jià)高稀釋倍數就高，教科書(shū)上抗血清稀釋倍數一般從1∶40開(kāi)始)，加入1號管,混勻后,取0.5 ml加入2號管,混勻,取0.5 ml加入3號管,依次稀釋,8號管混勻后吸0.5 ml棄去,10號管為對照管,從10號管開(kāi)始,從后向前依次加入0.5 ml傷寒桿菌均“O”“H”菌懸液（7億/ml）［1］，各管混勻，置37 ℃靜置24 h，使抗原抗體充分反應，判斷效價(jià)見(jiàn)表2，以呈現50%凝集，出現“++”（上清液稍渾濁，凝集物明顯）的最高血清稀釋倍數為血清的效價(jià)。表2：傷寒桿菌“O”、“H”抗血清凝集效價(jià)測定（略）菌液+0.85%鹽水-免疫6只家兔傷寒桿菌抗血清的平均幾何效價(jià)，傷寒“O”抗血清為1∶16 060，“H”抗血清為1∶25 600（見(jiàn)表3）。將“O”“H”抗血清按一定比例混合后，血清適當稀釋代替傷寒病人血清，可得到理想的實(shí)驗結果。表3：傷寒桿菌“O”、“H”抗血清幾何平均滴度免疫途徑（略）實(shí)驗注意事項：細菌的培養要無(wú)菌操作，不能混入雜菌。所選用的兔子要預先用傷寒桿菌“O”、“H”菌液做抗體檢測，不能選用已有抗傷寒桿菌“O”、“H”抗體的兔子。在免疫兔子時(shí)注意注射器的滅菌消毒，針頭是否堵塞。注射耳緣靜脈時(shí)，先用酒精將耳緣靜脈來(lái)回擦，使它充血增粗，易于注射。在兩次耳緣靜脈注射后，兔子可能會(huì )出現身體不適，有拉稀或耳朵腐爛等癥狀，可減少注射量和次數，等好些再注射。收集血清時(shí)，將血液置于干燥的培養皿中，放4 ℃冰箱過(guò)夜，次日用滴管吸取，避免震動(dòng)，以免溶血影響血清質(zhì)量。

 

　3討論

 

　　經(jīng)過(guò)幾屆學(xué)生的實(shí)驗，作者認為自制的抗血清實(shí)驗效果好，使用方便，隨用隨取。這樣避免了因實(shí)驗材料的購買(mǎi)困難而影響實(shí)驗課的開(kāi)設，能保質(zhì)保量地完成實(shí)驗教學(xué)任務(wù)。經(jīng)濟效益較高，購買(mǎi)的抗血清價(jià)格昂貴且效價(jià)不高，而自制的抗血清不需要耗費太多的材料，可為學(xué)校節約實(shí)驗經(jīng)費。自制的傷寒桿菌抗血清還可用于血清學(xué)的凝集反應，即用已知的傷寒桿菌抗血清與傷寒桿菌菌懸液10億/ml結合，形成抗原抗體復合物，使學(xué)生對抗原、抗體抽象的概念得以了解，也可以觀(guān)察感覺(jué)到它的客觀(guān)實(shí)在，是一個(gè)建立免疫學(xué)概念的好實(shí)驗。

作者：蔡玲斐   《實(shí)用醫技雜志》(杭州師范學(xué)院，浙江杭州 310018)

 

　　參考文獻：

 

　�。�1］  揚履渭.微生物學(xué)及檢驗技術(shù)（沙門(mén)氏菌屬）［M］.廣州：廣東科技出版社，1992，4：155.

　�。�2］  蔡玲斐.不同免疫途徑制備傷寒抗血清效價(jià)的比較［J］.杭州醫學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報，2002，23(3)：106.