微生物檢驗比對考核的檢驗思路探討

【摘要】 目的  探討微生物檢驗比對考核的檢驗思路。 方法  以2005年廣東省疾病預防控制中心組織的微生物實(shí)驗室間比對試驗為例，對3號項目考核樣品使用現行有效的微生物檢驗技術(shù)規范和相關(guān)傳染病診斷標準進(jìn)行鑒定。 結果  根據組織單位提供的已知提示，并充分利用自己的已知知識，盡量縮小范圍，檢出3號項目考核樣品是宋內志賀菌Ⅰ相和福氏志賀菌2a型的混合菌株。 結論  參加微生物檢驗比對考核時(shí)要充分利用已知知識進(jìn)行檢驗，并要留意樣品是純菌株還是混合菌株。      

 

 

　　【關(guān)鍵詞】  比對考核;宋內志賀菌Ⅰ相;福氏志賀菌2a型;混合菌株;純菌株

 

 

　　在微生物檢驗中，無(wú)論是日常工作或是比對考核，如果不知菌株來(lái)源，即不知菌株采集于人體何部位，采集于何種食物、使用物品或環(huán)境時(shí)，對未知菌株的分離鑒定，目前沒(méi)有固定的檢驗程序［1～4］ ，只有在確定了菌株的來(lái)源或針對性要檢驗某個(gè)可疑菌屬，才有相關(guān)來(lái)源菌的檢驗流程［1］ 或相關(guān)菌屬的檢驗程序 ［2］ 。微生物檢驗比對考核一般說(shuō)明菌株來(lái)源或指明了某一方向，對未知菌株進(jìn)行鑒定時(shí)可以根據這些提示來(lái)縮小檢驗范圍。下面以2005年廣東省疾病預防控制中心組織的微生物實(shí)驗室間比對試驗為例，探討微生物檢驗比對考核的檢驗思路。對3號項目考核樣品進(jìn)行檢驗，檢驗思路和檢驗結果如下。

 

　　1 對象、試劑、儀器和方法    

 

　　1.1 對象 廣東省疾病預防控制中心提供的比對考核3號項目考核樣品。   

 

　　1.2 試劑 各種微生物檢驗用染色液試劑、增菌培養基試劑、分離培養基試劑、生化試驗試劑和鑒定血清試劑。

 

　　1.3 儀器 生化培養箱、冰箱、顯微鏡。   

 

　　1.4 方法 《全國臨床檢驗操作規程》（第2版）-1997;《食品衛生微生物學(xué)檢驗》GB/T4789.1～31-2003;《傳染病診斷標準及相關(guān)法規匯編》-2003。

 

　　2 檢測思路和檢測結果    

 

　　2.1 樣品來(lái)源及樣品性狀廣東省疾病預防控制中心提供的微生物實(shí)驗室間比對項目的3號項目樣品，是從1例急性腸道傳染病病人糞便中分離出的腸道致病菌培養物，屬需氧或兼性厭氧菌。該樣品為子彈管裝凍干粉劑菌株，樣品運送溫度為常溫。   

 

　　2.2 檢測思路 從已知條件來(lái)看，從需氧狀況看，該菌株屬需氧或兼性厭氧菌可以排除厭氧菌;運送溫度為常溫，說(shuō)明該菌株是中溫菌，可以排除嗜冷菌、嗜熱菌;該菌株來(lái)源于1例急性腸道傳染病人的糞便，說(shuō)明該菌株為腸道菌，而且是致病菌，可引起急性致病，可以排除腸道正常菌群和腸道條件致病菌。根據《全國臨床檢驗操作規程》（第2版）-1997提供的糞便標本中常見(jiàn)的病原菌種類(lèi)，不是厭氧菌的革蘭陽(yáng)性菌有:金黃色葡萄球菌、結核分枝桿菌、白色念珠菌;革蘭陰性菌有傷寒及其它沙門(mén)菌、志賀菌、致病大腸埃希菌、弧菌屬菌種、氣單胞菌種、鄰單胞菌、小腸結腸炎耶爾森菌、彎曲菌。鑒定時(shí)可以將范圍縮至這11種菌，培養基可以選擇這11種菌的增菌培養基和分離培養基。在選擇增菌培養基和分離培養基時(shí)，要充分考慮各種類(lèi)型的常用培養基和專(zhuān)用培養基。

 

　　2.3 培養、觀(guān)察和鑒定   

 

　　2.3.1 復蘇培養 由于該樣品為子彈管裝凍干粉劑菌株，無(wú)法直接涂片鏡檢，必須進(jìn)行復蘇培養。用接種環(huán)挑取凍干粉劑菌株分別接種于營(yíng)養肉湯中，36℃分別培養6h;接種于加有血清的布氏肉湯中，43℃微需氧培養8h。   

 

　　2.3.2 接種 挑取—接種環(huán)于營(yíng)養肉湯分別直接劃線(xiàn)接種于一塊普通瓊脂平板和一塊血瓊脂平板中，36℃培養24h。同時(shí)接種普通瓊脂平板和血瓊脂平板，除可以觀(guān)察菌落形態(tài)特征外，還可以互相對比觀(guān)察該菌的營(yíng)養要求、色素及溶血性等。   

 

　　2.3.3 增菌培養 吸取生長(cháng)良好的營(yíng)養肉湯培養物0.5ml接種于下列增菌液:堿胨水、SC增菌液、GN增菌液、腸道菌增菌肉湯、氯化鈉結晶紫增菌液、7.5%氯化鈉肉湯、改良PBS。其中GN增菌液36℃培養6h、堿胨水36℃培養8h，改良PBS4℃培養1天、3周，其它增菌液36℃培養24h。吸取加有血清的布氏肉湯培養物0.5ml接種于CEM增菌液，43℃微需氧培養48h。   

 

　　2.3.4 分離培養 將上述增菌液分別接種于下列平板培養。（1）堿胨水-四號瓊脂平板和TCBS平板，36℃培養24h。（2）SC增菌液-SS平板和EMB平板，36℃培養24h。（3）GN增菌液-SS平板和EMB平板，36℃培養24h。（4）腸道菌增菌肉湯-SS平板、HE平板、麥康凱平板和EMB平板，36℃培養24h。（5）氯化鈉結晶紫增菌液-TCBS平板，36℃培養24h。（6）7.5%氯化鈉肉湯-血瓊脂平板，36℃培養24h。（7）改良PBS-NYE平板和麥康凱平板，分別在22℃和36℃培養48h。（8）CEM增菌液-Camp-BAP血瓊脂平板、Skirrow血瓊脂平板，43℃微需氧培養48h。   

 

 

　　2.3.5 菌落形態(tài)觀(guān)察 （1）普通瓊脂平板36℃培養24h后平板上生長(cháng)形成中等大小、無(wú)色透明、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形態(tài)一致。（2）血瓊脂平板36℃培養24h后平板上生長(cháng)形成中等大小、白色、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形態(tài)一致。（3）SS平板、麥康凱平板和EMB平板36℃培養24h后平板上分別生長(cháng)形成中等大小、無(wú)色透明、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形態(tài)一致。（4）HE平板36℃培養24h后平板上生長(cháng)形成中等大小、綠色透明、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形態(tài)一致。（5）SS平板、麥康凱平板和EMB平板在36℃培養48h后菌落發(fā)生變化:SS平板、EMB平板的菌落變粉紅色;麥康凱平板上的菌落變灰白色，并形成粗糙形菌落。   

 

 

　　2.3.6 染色鏡檢 各挑取普通瓊脂平板、血平板、SS平板、HE平板、麥康凱平板和EMB平板上單個(gè)菌落，染色鏡檢，發(fā)現革蘭陰性的短小桿菌，菌體形態(tài)一致。   

 

 

　　2.3.7 純培養及初步生化試驗 挑取各平板上的單個(gè)菌落接種于三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體，36℃培養24h。每個(gè)平板挑取5個(gè)菌落分別接種5支三糖鐵瓊脂、挑取5個(gè)菌落分別接種五支葡萄糖半固體，防止漏檢。觀(guān)察可見(jiàn)所有三糖鐵瓊脂培養物均發(fā)酵葡萄糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵乳糖、蔗糖;所有葡萄糖半固體培養物發(fā)酵葡萄糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、沿穿刺線(xiàn)生長(cháng)、無(wú)動(dòng)力。   

 

　　2.3.8 氧化酶試驗 挑取各平板培養物、三糖鐵培養基培養物做氧化酶試驗:均為陰性。   

 

　　2.3.9 血清學(xué)分型 根據該菌的培養特性、營(yíng)養要求、菌落形態(tài)和菌體形態(tài)特征及初步生化試驗、氧化酶試驗結果，挑取三糖鐵瓊脂上的培養物，做下列玻片凝集試驗，觀(guān)察結果。   

 

　　志賀菌4種多價(jià)診斷血清:凝集;宋內志賀菌血清:凝集;宋內志賀菌Ⅰ相血清:凝集。其中有1支從GN增菌液分離到SS平板再接種到三糖鐵瓊脂上的三糖鐵瓊脂培養物，志賀菌4種多價(jià)診斷血清不凝集;將菌液煮沸后再做玻片凝集試驗，仍然不凝集;用鮑氏多價(jià)1、2、3分別檢查，也不凝集;用痢疾志賀菌3～12型多價(jià)血清檢查，也不凝集;將此三糖鐵瓊脂培養物進(jìn)行傳代培養后，再做玻片凝集試驗。志賀菌4種多價(jià)診斷血清:凝集;福氏志賀菌多價(jià)血清:凝集;福氏志賀菌2型血清:凝集;福氏志賀菌群3，4因子血清:凝集;   

 

　　2.3.10 進(jìn)一步生化反應 志賀菌屬血清凝集的細菌，還需用生化試驗進(jìn)一步確認，防止診斷血清出現假陽(yáng)性反應。

 

　　2.3.10.1 挑取三糖鐵培養基培養物進(jìn)行下列生化試驗，觀(guān)察結果。    

　　表1 宋內志賀菌Ⅰ相血清凝集的三糖鐵瓊脂培養物生化試驗（略）

　　注:“+”為陽(yáng)性;“-”為陰性    

　　表2 福氏志賀菌2型血清、群3，4因子血清凝集的三糖鐵瓊脂培養物生化試驗（略）

　　注:“+”為陽(yáng)性;“-”為陰性    

　　2.3.10.2 挑取三糖鐵培養基培養物進(jìn)行下列生化分群試驗，觀(guān)察結果。    

　　表3 宋內志賀菌Ⅰ相血清凝集的三糖鐵瓊脂培養物生化試驗（略）

　　注:“+”為陽(yáng)性;“-”為陰性    

　　表4 福氏志賀菌2型血清、群3，4因子血清凝集的三糖鐵瓊脂培養物生化試驗（（略）

　　注:“+”為陽(yáng)性;“-”為陰性    

　　2.3.11 鑒定結果 檢出宋內志賀菌Ⅰ相和福氏志賀菌2a型。    

　　3 討論    

 

　　3.1 對未知菌株的鑒定，一般可以采用下列順序直接涂片鏡檢、增菌培養、分離培養、菌落和菌體觀(guān)察、純培養、生化反應試驗和血清學(xué)鑒定、藥物敏感性試驗和動(dòng)物實(shí)驗。藥物敏感性實(shí)驗和動(dòng)物實(shí)驗按菌株鑒定要求做。本例比對考核由于該樣品為凍干粉劑菌株，無(wú)法直接涂片鏡檢，必須先進(jìn)行復蘇培養、增菌培養、接種平板后才能鏡檢。    

 

　　3.2 鑒定菌株的首要條件是將菌株進(jìn)行純培養對分離培養物進(jìn)行菌落觀(guān)察和鏡檢觀(guān)察菌體形態(tài)，只有菌落形態(tài)和菌體形態(tài)都一致時(shí)，才能進(jìn)行純培養和鑒定，否則還須繼續分純。挑取菌落形態(tài)和菌體形態(tài)都一致的可疑菌落進(jìn)行純培養，然后再對純菌株進(jìn)行一系列的鑒定。進(jìn)行純培養時(shí)，當需要細菌數量較多時(shí)，應用分離平板進(jìn)行純培養;若只需少量細菌，可用三糖鐵瓊脂進(jìn)行純培養，并可同時(shí)觀(guān)察初步生化反應。由于某些菌屬之間或同菌屬不同菌型的細菌之間的菌落形態(tài)及菌體形態(tài)相似，進(jìn)行純培養時(shí)，應在同一平板上多挑幾個(gè)單個(gè)菌落進(jìn)行純培養，防止不同菌屬之間或同菌屬不同菌型的細菌之間出現漏檢。   

 

　　3.3 有條件的單位可以使用自動(dòng)化鑒定系統［4］  既可以大大縮短檢驗時(shí)間又可以節省大量的工作量。自動(dòng)化鑒定雖然還不是國家標準方法，但其結果可以作為未知菌株鑒定的參考。   

 

　　3.4 質(zhì)量控制 整個(gè)檢驗過(guò)程注意無(wú)菌操作，使用空白對照，陰、陽(yáng)性對照，可以保證試驗的成功;染色液、培養基、試劑、診斷血清等要在有效期內使用，并且要用已知參考菌株進(jìn)行測試;選用合適的鑒定系統，并將分離菌株與相關(guān)的參考菌進(jìn)行比較，可以有效保證實(shí)際應用鑒定系統。

作者：李義強    中華醫藥雜志 2005年8月 第5卷 第8期

 

　　【參考文獻】    

　　1 中華人民共和國衛生部醫政司.微生物學(xué)檢驗，全國臨床檢驗操作規程，第2版.1997，437-576.

　　2 中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會(huì ).中華人民共和國國家標準，食品衛生微生物學(xué)檢驗，2003，1-249. 

　　3 衛生部衛生監督中心衛生標準處.傳染病診斷標準及相關(guān)法規匯編，2003，53-305.    

　　4 東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細菌系統鑒定手冊，北京:人民衛生出版社，2001，57.