細菌自動(dòng)鑒定及藥敏系統的研究進(jìn)展(1)

一、細菌自動(dòng)鑒定及藥敏系統的發(fā)展史

細菌的鑒定是細菌分類(lèi)的實(shí)驗過(guò)程，長(cháng)期以來(lái)，臨床微生物實(shí)驗室一直沿用100多年前由Gram、Pasteur、Koch、Petri等創(chuàng )造的傳統的微生物學(xué)鑒定方法。這些傳統的鑒定方法不僅過(guò)程煩瑣，費時(shí)費力，且在方法學(xué)和結果的判定、解釋等方面易發(fā)生主觀(guān)片面而引起的錯誤，難以進(jìn)行質(zhì)量控制。

20世紀60年代以后，微生物學(xué)家和工程技術(shù)人員密切合作，對微生物的研究采用了物理的、化學(xué)的分析方法，發(fā)明了許多自動(dòng)化儀器，并根據細菌不同的生物學(xué)性狀和代謝產(chǎn)物的差異，逐步發(fā)展了微量快速培養基和微量生化反應系統，使原來(lái)緩慢、煩瑣的手工操作變得快速、簡(jiǎn)單，并實(shí)現了自動(dòng)化和機械化。微生物鑒定自動(dòng)化方法，包括(1)臨床微生物鑒定系統；(2)氣液色諳分析；鑒定厭氧菌和分枝桿菌多用于研究；(3)核酸雜交；多用于研究；(4)化學(xué)發(fā)光技術(shù)；可鑒定一些細菌少數分枝桿菌屬和一些真菌。80到90年代發(fā)展迅速，并廣泛用于臨床。1985年第一臺自動(dòng)化細菌分析儀器Vitek-AMS進(jìn)入中國并成功使用。1999年底法國梅里埃公司推出VITEK2系統，從接種物稀釋、密度計比較及卡沖填和封卡等步驟均實(shí)現了全自動(dòng)化。目前已有多種微生物自動(dòng)鑒定及藥敏測試系統問(wèn)世，如VITEK-AutoMicrobicSystem(AMS)、PHOENIXTM、MicroScan、Sensititre、ABBott(MS-2 System)、AUTOBACIDXSys-tern等。這地自動(dòng)化系統具有先進(jìn)的微機系統，廣泛的鑒定功能，適用于臨床微生物實(shí)驗室、衛生防疫和商檢系統，主要功能包括細菌鑒定、細菌藥物敏感性試驗及最低抑菌濃度(MIC)的測定等。其準確性和可靠性均已大大提高。

二、細菌自動(dòng)鑒定及藥敏系統原理及性能比較

1.原理：

臨床微生物鑒定系統使細菌鑒定過(guò)程規范化和程序化，將細菌對底物的生化類(lèi)型與已建立數據庫類(lèi)型相比較。測試原理主要是利用物質(zhì)產(chǎn)生PH值變化，能釋放色源或熒光源復合物的酶學(xué)反應，四氮唑標記碳水化合物代謝活性的產(chǎn)生，揮發(fā)或非揮發(fā)酸產(chǎn)生，或可見(jiàn)生長(cháng)。

2．采有上述原理的各種鑒定系統可鑒定腸桿菌科菌。 目前較完善的鑒定系統性能比較。非發(fā)酵菌，革蘭陽(yáng)性球菌，革蘭陰性球菌，厭氧菌和酵母

 

三、常見(jiàn)細菌自動(dòng)鑒定及藥敏系統工作原理

 

（一）半自動(dòng)微生物鑒定和藥敏系統

 

1．VITEK-ATB

 

　　ATB鑒定系統是將肉眼觀(guān)察的結果輸入電腦，計算機數據庫由許多細菌條目(taxa)組成，將輸入結果與數據庫內細菌條目比較，自動(dòng)地得到鑒定結果。ATB敏感性試驗采用半固體瓊脂培養叢，不同的藥敏試條含有不同種類(lèi)的抗生素，每種抗生素都設有兩個(gè)關(guān)鍵性的濃度，在24小時(shí)內通過(guò)觀(guān)察有(+)無(wú)(一)細菌生長(cháng)以判斷藥敏試驗結果。結果可直接判讀為：敏感，中介或耐藥。由讀數儀和電腦兩部分組成。系統是由API金標準改良而成，擁有龐大的細菌資料庫以及嚴格的質(zhì)控，可鑒定多達550種細菌。另外，ATB系統操作方便，只需將培養結果輸入電腦，就可得到結果。

 

2．MicroScan Panel

 

　　使用測試板及快速接種系統，人工判讀，將編碼結果輸入電腦，由電腦軟件得出反應結果。操作簡(jiǎn)便，價(jià)格便宜。

 

3．Sensititre ManualSystem(手動(dòng)裝置)原理和操作方法同以上兩種半自動(dòng)方法。

 

（二）自動(dòng)微生物鑒定和藥敏系統

 

1．AutoScan-4自動(dòng)微生物鑒定／藥敏分析儀

 

　　試劑板在培養箱孵育，然后放主機，用比色法及比濁法對鑒定及藥敏(MIC)進(jìn)行測定，96條不同波長(cháng)光導纖維，對96孔板同時(shí)測定。儀器由主機，電腦和打印機組成。

將菌液加入試劑板，放培養箱孵育(35～C左右)18～24小時(shí)。將試劑板放入主機，儀器自動(dòng)判讀結果�？赏瑫r(shí)做鑒定和藥敏，自動(dòng)判讀結果，操作簡(jiǎn)便。

 

2．AutoReader自動(dòng)微生物鑒定／藥敏分析儀

 

　　用熒光檢測技術(shù)，在測定板底物中加入入酶介物，使其與細菌生長(cháng)中的酶結合生成熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)通過(guò)熒光讀數儀得出的生物編碼（BIOCODE）來(lái)判定菌種。

 

（三）Vitek-AMS（Automated Microbic System）全自動(dòng)細菌鑒定和藥敏分析系統工作原理

 

1．概況：

 

　　Vitek-AMS（Automated Microbic System）全自動(dòng)細菌鑒定和藥敏分析系統，1960年由美國航天系統的麥克唐納，道格拉斯公司為了鑒定宇宙環(huán)境中的微生物而研制的。1973年正式應用于臨床微生物檢驗。1989年該系統由麥克唐納，道格拉斯公司轉讓給法國生物梅里埃集團。全世界有4246家實(shí)驗室應用，國內用戶(hù)110臺。(1996年資料) 自1985年第一臺自動(dòng)化細菌分析儀器Vitek-AMS進(jìn)入中國并成功使用。價(jià)格7．8萬(wàn)美元。

 

2．結構組成

 

　　VITEK CC4自動(dòng)鑒定系統由菌液接種、封閉裝置(此裝置分上下兩部分，下部分為真空室，上部是一熱切割器)．讀數器、孵箱和電腦、打印機三部分組成。

 

(1)充液/封口部件 這一部件分為上、下兩部分。上部為封口器并有切割作用，下部為真空充液接種裝置。將制備好菌懸液的試管和試卡用一彎形塑料管相連并置充液接種倉中，當接Fill鈕時(shí)，即開(kāi)始抽真空，真空形成后進(jìn)氣閥開(kāi)放，倉內形成負壓，菌液從試管通過(guò)彎形塑料管進(jìn)入試卡內即完成接種，上部封口為一熱切割器，溫度可升至200℃以上，完成按種的試卡可置熱切割器中，密閉并切割平整。

 

(2)孵箱／讀數器 孵箱內有一直立圓形轉盤(pán)，每隔900置一卡片架，每個(gè)孵箱共可放4個(gè)卡片架，每一個(gè)卡片架分別用 A、B、C、D標記，每—卡片架可放32張測試卡。孵箱直接由計算機控制，讀數器是665nm波長(cháng)的光掃描器，每15min自動(dòng)掃描一次，并將光信號轉換為電信號傳送至計算機。

 

(3)計算機、終端和鍵盤(pán) 計算機就像整個(gè)系統的神經(jīng)中樞，始終保持與孵箱／讀數器、打印機和終端的聯(lián)絡(luò )，控制孵箱溫度，自動(dòng)定時(shí)讀數，收集記錄，儲存和分析資料。當卡片反應完成時(shí)，計算機可指示打印機自動(dòng)打印報告。使用者可隨時(shí)從終端查詢(xún)試卡檢測結果，配有IMS裝置的計算機還具有數據統計功能，該系統計算機還可同時(shí)帶動(dòng)兩個(gè)孵箱／讀數器并可與自動(dòng)免疫診斷系統——VIDAS聯(lián)用。終端是由21cm彩色顯像管組成。終端可提供人機對話(huà)并與各部件聯(lián)絡(luò )，當系統出現故障會(huì )自動(dòng)報警。鍵盤(pán)為102標準鍵擻，通過(guò)鍵盤(pán)可建立適合各類(lèi)實(shí)驗室的框架。輸入指令或菜單，控制系統的運動(dòng)狀態(tài)，輸入各檢測樣本的流行病學(xué)資料。

 

(4)打印機 打印機始終與計算機保持聯(lián)絡(luò )，接受計算機發(fā)出的命令，自動(dòng)打印每一試卡的最終報告，包括實(shí)驗室保留的short report和發(fā)給臨床醫生的patient report，并自動(dòng)打印系統出現的故障資料。

 

3．原理

 

(1)鑒定原理：

 

　　常規革蘭剛(陰)性板對各項生化反應結果(陰性或陽(yáng)性)的判定是根據比色法的原理，將菌種接種到鑒定板后進(jìn)行培養，由于細菌各自的酶系統不同，新陳代謝的產(chǎn)物也有所不同，而這些產(chǎn)物又具有不同的生化特性，因此各生化反應的顏色變化各不相同。儀器自動(dòng)每隔1小時(shí)測定每—生化反應孔的透光度，當生長(cháng)對照孔的透光度達到終點(diǎn)閾值時(shí)，指示已完成反應。由光電技術(shù)、電腦技術(shù)和細菌八進(jìn)位制數碼鑒定相結合。每個(gè)鑒定卡內含有30項生化反應，每3項為一組，各確立陽(yáng)性反應值為1、2、4：如3項反應全部陽(yáng)性，其組值為7；如第1、2項反應陽(yáng)性，其組值為3；第1、3項反應陽(yáng)性，其組值為5。30項生化反應可獲得10位數的生物數碼，在鑒定時(shí)有時(shí)還需外加補充試驗，共可獲得11位生物數碼，系統將其最后一次判讀的結果所得生物數碼與菌種資料庫標準菌生物模型相比較，得到鑒定值和鑒定結果，并自動(dòng)打印出實(shí)驗報告和發(fā)給病人的病房報告。

 

(2)藥敏實(shí)驗原理

 

　　藥敏測試板(卡)的藥物敏感性試驗實(shí)質(zhì)是微型化的肉湯稀釋試驗。應用光電比濁原理，根據不同的藥物對不同的菌最低抑菌濃度不同，每一種藥物一般選用3種不同藥物濃度，每一藥敏試卡可同時(shí)作10種藥物的MIC(minimal inhibitory concentration)測定，經(jīng)6小時(shí)孵育后，每隔一定時(shí)間自動(dòng)測定小孔中細菌生長(cháng)狀況，即可得到待測菌在各濃度的生長(cháng)率。待檢菌斜率與陽(yáng)性對照孔斜率之比值，經(jīng)回歸分析得到MIC值，并根據NCCLLS(美國國家臨床實(shí)驗室標準化委員會(huì ))標準獲得相應的S、I和R結果。藥敏報告含MIC值，敏感度，藥物一次劑量和在該劑量下的血清和尿液內最高藥物濃度。

 

4．主要操作步驟

 

(1)光電比濁儀

 

　　革蘭氏陽(yáng)性菌配制相當0.5麥氏管菌懸液，革蘭氏陰性菌配制相當1麥氏管菌懸液、酵母菌配制相當2麥氏管菌懸液，厭氧菌配制相當大于2麥氏管菌懸液。

 

(2)菌液接種和封閉

 

(3)卡片裝入讀數器／孵箱。

 

(4)輸入病人人口統汁學(xué)資料。

 

(5)自動(dòng)打印實(shí)驗室和病人報告。

 

5．系統功能和特點(diǎn)

 

(1)鑒定功能

 

　　系統具有對不同菌類(lèi)的鑒定能力，含有鑒定試卡十種，包括

 

A．GNI卡(革蘭氏陰性桿菌)：可鑒定腸道菌和非發(fā)酵菌117種。

B．GPI卡(革蘭氏陽(yáng)性球菌)：可鑒定葡萄球菌、鏈球菌及其他細菌49種。

C．YBC卡(酵母菌)：可鑒定酵母樣真菌36種。

D．BAC卡(需養芽孢桿菌)：可鑒定芽孢桿菌12種。

E．ANI卡(厭氧菌)：可鑒定87種。

F．NIH卡(奈瑟氏菌、嗜血桿菌)：可鑒定奈瑟氏菌、嗜血桿菌和其它苛氧菌30種。

G．NFC卡(非發(fā)酵型革蘭氏陰性細菌)：可鑒定非發(fā)酵型革蘭氏陰性細菌。

H．GNI+卡：快速革蘭氏陰性菌鑒定卡。

　篩選卡

L．UID-3卡：尿道感染專(zhuān)用鑒定和藥敏卡

M．ESP-3卡：腸道病原菌

 

　　可鑒定不同種類(lèi)的細菌近500種。系統設計，直接同樣本鑒定，使結果提前二十四小時(shí)，并報告菌落計數，鑒定功能和參考方法比可獲得百分之九十五以上的相關(guān)率。

 

(2)藥敏試驗

 

　　革主氏陰性桿菌藥敏試二十種，革蘭氏陽(yáng)試卡三種，尿道分離菌藥敏試卡，超廣譜(—內酰胺酶試卡，最近又開(kāi)發(fā)出四十五孔試卡。涉及為九十七種抗生素，并含有測定超廣譜(—內酰胺酶(ESBL)功能的試卡(GNS—NT)。在革蘭氏陽(yáng)性菌藥敏試卡中含有(—內酰胺酶試驗。

 

(3)專(zhuān)家系統軟件

 

　　所謂專(zhuān)家系統是用計算機軟件來(lái)代替有豐富經(jīng)驗的專(zhuān)家審核，該系統產(chǎn)生報告中的技術(shù)錯誤和異常的藥物表型，TITEK專(zhuān)家系統有144條規則，規則分為三級水平，一級水平是極不可能出現的表型，二級是罕見(jiàn)表型，三級是利用一種藥物表型推理另外一些藥物的耐藥性。專(zhuān)家系統規則，每天審核異常藥敏規則，使檢驗醫生可對報告進(jìn)行修訂或重復處理。

 

(4)數據處理軟件

 

　　可根據用戶(hù)需要，打印出二十八種流行病學(xué)和統計報告，統計報告內容是：菌種發(fā)生率報告、抗生素敏感率統計報告、細菌對抗生素累積敏感率報告、細菌對抗生素累積MIC報告、每月細菌發(fā)生率報告、每月細菌敏感率報告、工作量報告、生物模式統計報告、根據不同試卡種類(lèi)統汁的敏感性報告。

 

(5)優(yōu)點(diǎn)：

 

　　結果檢出迅速，最快2-4小時(shí)鑒定出結果，準確度高，本機設有專(zhuān)家系統軟件，該系統匯集了細菌學(xué)家、藥學(xué)家及基礎醫學(xué)家智慧而研制的軟件，用于審核評價(jià)現時(shí)藥敏報告中耐藥表型的可能性和正確性。多種形式的結果統計，幫助細菌室了解院內某種細菌的感染率、細菌的耐藥趨勢等情況。

 

6．注意事項

 

(1)首先一定要調驗好光電比色計0點(diǎn)和100％點(diǎn)。

(2)細菌一定要純。(菌落不純一定要分純后再上儀器鑒定。)

(3)儀器報警一定要及時(shí)處理。

 

7．儀器保養

(1)每日用布水擦機身，每周沾70％酒精擦填充器。

(2)2-3各月用無(wú)水乙醇擦鏡片。

(3)1—2個(gè)月用清洗帶清洗備份磁頭。