幽門(mén)螺桿菌熱休克蛋白A亞單位基因的克隆表達及免疫原性

幽門(mén)螺桿菌（Hp）與胃炎、消化性潰瘍、胃癌、胃淋巴瘤等關(guān)系密切。Hp在我國普遍人群的感染率約50%～80%，可經(jīng)口傳播。如何預防和根除Hp感染是目前臨床治療的重點(diǎn)。免疫療法有望成為預防和治療該類(lèi)感染性疾病的最有效方法之一［1］。在Hp的免疫防治研究方面，應用細菌的超聲粉碎抗原、純化尿素酶（Ure）、細胞空泡毒素和熱休克蛋白(Hsp)等作為抗原免疫動(dòng)物均取得了較好的免疫預防和治療效果［2-4］。但由于Hp屬微需氧菌，培養條件要求高，難以獲得大量天然來(lái)源的Ure及Hsp等亞單位成分，我們對Hp重要的保護性抗原h(huán)spA基因進(jìn)行了克隆表達并用于臨床檢測，現將結果報告如下。

 

　　一、材料與方法

 

　　1.質(zhì)粒、菌株及血清來(lái)源：質(zhì)粒PinPointTMXa-3購自Promega公司，E.coli JM109及Hp菌株為本室保存菌種。血清采自西南醫院因上消化道癥狀就診患者40例。其中男性20例，女性20例，年齡20～76歲，平均46歲。正常人血清采自尿素酶法陰性無(wú)消化道癥狀者20名。

 

　　2.酶及試劑：EcoRV、 HindⅢ購自寶靈曼公司，T4連接酶、Taq DNA聚合酶、RNase、PCR Markers、低分子量標準蛋白Markers購自華美生物工程公司。辣根過(guò)氧化物標記的鏈霉親和素(S-A/HRP)購自中山生物工程公司，SoftLinkTM親和樹(shù)脂購自Promega公司，其他常規試劑為分析純。

 

　　3.質(zhì)粒的制備：DNA片段分離回收，DNA連接，細菌轉化，重組菌的培養條件和誘導及表達產(chǎn)物的SDS-PAGE、免疫印跡分析均按常規方法進(jìn)行。

 

　　引物1：5′-CCCAAGCTTATGAAGTTTCAACC-3′

 

　　HindⅢ

 

　　引物2：5′-GACGATATCTAAATGACAGCGAGCTTC-3′

 

　　EcoRⅤ

 

　　4.親和層析純化：表達產(chǎn)物采用PinPointTMXa純化系統純化。將1 000 ml LB培養基制備的菌體離心處理后溶于20 ml pH 7.0的PBS洗中，超聲粉碎，8 000 g離心15 min緩緩加樣(＜1 ml/min)，至少用5×柱床體積的PBS液洗柱，用含5 mmol/L生物素的100 mmol/L PBS緩沖液洗脫。收集，透析以除去游離生物素。

 

　　5.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定表達產(chǎn)物的活性：以抗血清為一抗，加酶標單抗人抗體稀釋液為二抗，上樣及免疫顯色均按常規方法進(jìn)行。

 

　　二、結果

 

　　1.構建HspA的基因片段與載體PinPointTMXa-3融合表達質(zhì)粒經(jīng)酶切分析及序列測定為重組質(zhì)粒。

 

　　2.HspA在JM109中的表達及純化：重組菌經(jīng)IPTG誘導后，用PinPointTMXa純化系統親和層析柱分離純化得到可溶性表達的HSPA融合蛋白，純度在90%以上。

 

　　3.應用純化的融合蛋白HspA，采用ELISA方法檢測臨床標本40例，8例血清與重組蛋白HspA反應陽(yáng)性，陽(yáng)性率20%，20例正常人血清與之無(wú)交叉反應。

 

　　三、討論

 

　　熱休克蛋白是幽門(mén)螺桿菌共有的抗原成分。HspA誘發(fā)機體產(chǎn)生保護性免疫反應已得到證實(shí)［5，6］。近年來(lái)對HspA抗原成分的研究受到重視。在本研究中，采用基因工程的方法獲得了表達HspA特導性抗原的重組菌株，又經(jīng)親和層析純化獲得足量的HspA純品，用ELISA方法檢測的8例陽(yáng)性標本均為胃潰瘍或十二指腸潰瘍明確病史十年以上，證實(shí)了Perez等HspA血清抗體陽(yáng)性是Hp長(cháng)期感染的結論［7］。同時(shí)檢測非Hp感染患者20例，均為陰性，無(wú)非特異性交叉反應。此方法操作簡(jiǎn)便，一次可完成多份標本的檢測，具有無(wú)創(chuàng )傷和重復性好的優(yōu)點(diǎn)，可用作Hp感染的初篩。

 

　　基金項目：國家“九五”重點(diǎn)科技攻關(guān)課題(96-901-01-54)；全軍“九五”醫藥衛生科研基金課題(98D044)

作者：郭學(xué)青　鄒全明  中華醫學(xué)檢驗雜志 2000年第6期第23卷

　　參考文獻

 

　　1，Chen MH.Chen BL.The prospect and actuality on Helicobacter pylori vaccine. Weichangbingxue,1996,2:32.

　　2，Michetti P, Crothesy-T heulaz I, Davin C, et al.Immunization of BALB/c mice against Helicobacter felis infection with H. elicobacter pylori urease. Gastroenterology, 1994, 107:1002-1011.

　　3，Manetti R, Massari P, Burroni D, et al. Helicobacter pylori cytotoxin :importance of native conformation for induction of neutralizing antibodies.Infect Immun, 1995, 11:4476-4480.

　　4，Ferrero RL, Thiberge JM, Kansau I, et al. The Groes homolog of Helicobacter pylori confers protective immunity against mucosal infection in mice.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:6499-6503.

　　5，Maarta M, Beatrice A, Daniela B, et al. Development of a mouse model of Helicobacter pylori ilnfection that mimics human disease. Sciense,1995,23:267.

　　6，Ferrero RL.Thiberge I.Kansay I.Immunisation with helicobacter pylori heat-shock protein A(HspA) and urease B (UreB) affords total protection against H felis infection of mice. Gut, 1995, 37 Suppl,1 :51.

　　7，Perez GI, Thiberge JM, Labigne A, et al. Relationship of immune response to Heat-shock protein A and characteriatics of Helicobacter pylori infected patients. J Infect Dis, 1996，174:1.