5-HT 沙眼衣原體K血清型感染細胞IL-6分泌水平的測定

摘 要  目的:探討沙眼衣原體K血清型感染細胞IL-6分泌水平及其意義。方法:用ELISA雙抗體夾心法檢測沙眼衣原體感染細胞培養上清IL-6水平的變化。結果:沙眼衣原體感染McCoy細胞在沙眼衣原體感染后36h、48h、60h、IL-6分泌量分別為1.3655±0.0046、2.9601±0.0104、4.0408±0.0722，均顯著(zhù)高于相應的對照組（P<0.05），并且隨感染時(shí)間的延長(cháng)IL-6分泌水平顯著(zhù)地逐步增高（P<0.05）。結論:沙眼衣原體K血清型感染可誘導McCoy細胞分泌IL-6，并且呈時(shí)間依賴(lài)性。

 

    關(guān)鍵詞  沙眼衣原體;McCoy細胞;白細胞介素-6

 

     沙眼衣原體（Ct）的致病機制涉及機體的免疫防御和免疫病理反應，白細胞介素6（IL-6）作為重要的炎癥因子和免疫介導因子可能參與沙眼衣原體感染的致病過(guò)程。據報道，Ct能誘導體外培養的上皮細胞、人單核細胞、淋巴細胞等多種細胞產(chǎn)生IL-6等細胞因子［1，2］ ，而有關(guān)沙眼衣原體K血清型感染的McCoy細胞分泌細胞因子的報道尚少。本文檢測沙眼衣原體K血清型感染的McCoy細胞分泌IL-6水平，旨在為尋求衣原體感染性疾病的防治措施及進(jìn)一步的研究提供參考。

 

    1 材料

 

    沙眼衣原體K血清型由中山醫科大學(xué)寧波教授惠贈，McCoy細胞由湘雅醫學(xué)院病毒研究室惠贈，IL-6ELISA試劑盒（晶美公司產(chǎn)品），RPMI-1640（GIBCO產(chǎn)品）。

 

    2 方法

 

    2.1 衣原體增殖

 

    取一瓶單層McCoy細胞，棄上清，加1mL衣原體懸液至培養瓶中，3000r/min離心1h，37℃、5%CO 2 培養箱培養2h，棄上清。加無(wú)雙抗的RPMI-1640培養基（含10%小牛血清、1μg/mL放線(xiàn)菌酮），置37℃、5%CO 2 培養箱培養48h取出，凍融，500g離心10min，取上清（含衣原體），分裝于無(wú)菌

 

    小試管，70℃冰箱保存備用。

 

    2.2 衣原體滴定

 

    將增殖后的衣原體作系列稀釋?zhuān)�接種于已經(jīng)形成McCoy細胞單層的24孔培養板，培養48h，用熒光標記的抗衣原體單克隆抗體染色后于熒光顯微鏡下計數感染細胞百分率，并計算ID50值。 2.3. ELISA檢測IL-6含量

 

    在已形成McCoy細胞單層的24孔培養板中接種1ID50衣原體，并設正常細胞對照，3000r/min離心1h，37℃、5%CO 2 培養箱培養2h，棄上清。每孔加含10%小牛血清的RPMI-1640培養基1mL，37℃、5%CO 2 培養箱培養。于36h、48h、60h分別取培養上清，用ELISA雙抗體夾心法檢測IL-6含量（按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作）。在酶標儀上用405nm波長(cháng)測OD值。將試劑盒提供的IL-6標準濃度與測得的OD值經(jīng)SPSS統計軟件做標準曲線(xiàn)，得出回歸方程，根據樣本的OD值計算其IL-6含量。

 

　　 2.3 統計學(xué)處理

 

    實(shí)驗結果用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，顯著(zhù)性差異以P<0.05為準。

 

    3 結果

 

    3.1 標準曲線(xiàn)

 

    將IL-6標準品含量與測得的OD值用SPSS統計軟件處理獲得IL-6含量標準曲線(xiàn)（見(jiàn)圖1），得出回歸方程為:Y=1.9505+0.5967LnX（Y為OD值，Ln是以e為底的自然對數，X為IL-6濃  度）。 圖1 IL-6含量標準曲線(xiàn)

 

    3.2. ELISA雙抗體夾心法檢測IL-6的濃度

 

    結果見(jiàn)表1、圖2。Ct感染后36h、48h、60h細胞培養上清中IL-6的含量均顯著(zhù)高于相應的對照組（P<0.05），且隨感染時(shí)間的延長(cháng)IL-6含量顯著(zhù)地逐步增高（P<0.05）。 表1 沙眼衣原體感染McCoy細胞分泌IL-6 *與對照比較P<0.05，△與36h Ct組比較P<0.05，▲與48h Ct組比較P<0.05 圖2 沙眼衣原體感染McCoy細胞分泌IL-6的ELISA檢測結果

 

 

    3 討論

 

 

    IL-6為具有廣泛生物學(xué)效應的細胞因子，具有雙向免疫調節作用，也是機體炎癥反應和一系列病理生理過(guò)程的重要介質(zhì)。近年研究表明，Ct的致病機制與機體的免疫防御和免疫病理過(guò)程有關(guān)。細菌的脂多糖、病毒RNA、感染產(chǎn)生的中介物質(zhì)均能刺激感染細胞及免疫細胞產(chǎn)生IL-6。李海燕等報道，沙眼衣原體感染輸卵管性不孕患者輸卵管液中IL-6水平升高，IL-6水平與Ct的亞臨床感

 

 

    染或持續性感染狀態(tài)密切相關(guān) ［3］ 。本實(shí)驗用雙抗 體夾心法檢測IL-6分泌水平，結果顯示，Ct感染McCoy細胞引起IL-6分泌水平明顯增高，與文獻報道衣原體感染沙眼衣原體可促進(jìn)體外培養的上皮細胞、血管內皮細胞、巨噬細胞等分泌IL-6的結果類(lèi)似 ［1，2］。提示Ct感染后誘導細胞產(chǎn)生的IL-6可能通過(guò)調節機體的免疫功能而參與Ct感染的致病過(guò)程，且可能影響Ct感染的狀態(tài)。上述結果有待體內和臨床實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)。

 

 

    文獻報道，Ct感染的Hela細胞培養上清中24h可檢測到前炎癥性細胞因子IL-8顯著(zhù)增加，72h后達高峰，3d后，IL-8分泌開(kāi)始下降，可能與Ct繁殖周期48h～72h有關(guān)［4］ 。本實(shí)驗結果顯示，Ct感染的McCoy細胞在感染后24h分泌前炎癥細胞因子IL-6的水平顯著(zhù)高于對照組，且呈時(shí)間依賴(lài)性。提示Ct感染的McCoy細胞分泌IL-6的水平也許與Ct的繁殖周期有關(guān)。本實(shí)驗未檢測衣原體感染72h及72h后IL-6的分泌水平，故有待于進(jìn)一步研究闡明。

 

 

    IL-6和TNF、IL-1、IL-8等多種細胞因子協(xié)同構成復雜的炎性細胞因子網(wǎng)絡(luò )，參與多種炎癥性疾病的病理過(guò)程 ［5］。有文獻報道，Ct感染的U937細胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等多種細胞因子［6］ ，可能沙眼衣原體感染的McCoy細胞還產(chǎn)生其他的細胞因子，具體產(chǎn)生那些細胞因子及其相互作用，有待進(jìn)一步研究。

 

作者：張雄鷹 查國章 武延雋 余平   《長(cháng)治醫學(xué)院學(xué)報》 2005 年 12 月 第 20 卷 第 4 期

 

    參考文獻

 

    ［1］ Rasmussen SJ，Eckmann L，Quayle AJ，et al.Secretion of proin-flammatory cytokines by epithelial cells in response to chlamydia infec-tion suggests a central role for epithelial cells in chlamydia pathogene-sis.J Clin Invest，1997，99（1）:77.

 

    ［2］ Netea MG，Selzman CH，Kullberg BJ，et al.Acellular compo-nents of Chlamydia pneumoniae stimulate cytokine production in human blood mononuclear cells.Eur J Immunol，2000，30（2）:541.

 

    ［3］ 李海燕，梁占光.沙眼衣原體感染輸卵管性不孕患者輸卵管液中腫瘤壞死因子α和白細胞介素6的測定.中華婦產(chǎn)科雜志，2000，35（7）:411.

 

    ［4］ 余俊龍，余 平，李立新，等.沙眼衣原體感染誘導Hela細胞分泌IL-8和IL-10.湖南醫科大學(xué)學(xué)報，2003，28（2）:174.

 

    ［5］ Old LJ.Tumor necrosis factor.polypeptide mediator network.Na-ture，1987，326:330.

 

［6］ Rothermel CD，Scachter J，Lanrich P，et al.Chlamydia tra-chomatis induced production of interleukin-1by human monocyte.In-fect Immun，1989，57:2705.