利用細菌鑒定卡保存菌種

　微生物實(shí)驗室成功地進(jìn)行細菌菌種保存，對于系統地分析流行菌株的生物學(xué)、分子生物學(xué)特征和耐藥性的變遷，以及對醫院感染病原學(xué)調查、新藥臨床研究都十分重要［1］。我們通過(guò)對1998年1月～2000年5月兩年多時(shí)間冰凍保存的VITEK-GNI、GPI、YBC 3種生化鑒定卡共4 700株常見(jiàn)的細菌，選擇其中258株常見(jiàn)進(jìn)行復活再鑒定，以探討一種操作簡(jiǎn)便而又實(shí)用可靠的保存臨床標本分離細菌菌株的方法，現報道如下。

 

　　一、材料和方法

 

　　1.標本來(lái)源：258株1998年1月～2000年5月從痰、血、尿、膿液等標本中分離、純培養的細菌，用VITEK全自動(dòng)微生物分析儀分析后，其GNI、GPI、YBC生化卡當日即按流水號順序置-20 ℃冰箱保存。

 

　　2.儀器：VITEK全自動(dòng)微生物分析儀及配套生化卡、藥敏卡。生物梅里埃公司。

 

　　3.方法：把3種鑒定卡直接從-20℃移至35℃，待小孔液體完全融化后，以無(wú)菌手續，用注射器抽吸出陽(yáng)性生長(cháng)孔內的液體，點(diǎn)種于血平板或沙保弱平板，置35℃孵箱內24～48 h復蘇。復蘇菌落經(jīng)分離培養后，用VITEK系統對菌株進(jìn)行鑒定和藥敏試驗，以金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、綠膿假單胞菌ATCC27853作質(zhì)控。

 

　　二、結果

 

　　1.菌株復活率：258株細菌按初始鑒定的結果，以伯杰細菌分類(lèi)為依據，歸納為葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌科、腸球菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、念珠菌屬8大類(lèi)。各類(lèi)菌屬的細菌100%的存活時(shí)間：葡萄球菌屬、腸桿菌屬、念珠菌屬為29個(gè)月，腸球菌屬、黃桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬為21個(gè)月，鏈球菌屬和假單胞菌屬為10個(gè)月。

 

　　2.生物學(xué)特性及耐藥譜變化：258株細菌中共218株復活成功，復活菌株的培養特點(diǎn)、形態(tài)特征、生化特性均與初始鑒定結果一致，細菌的凍融復活前后藥敏譜也基本一致，符合率為93.7%～100%。

 

　　3.反復凍融的影響：從復活的各類(lèi)菌株中選取30株的生化卡反復凍融5次，每次冰凍的時(shí)間保持24 h以上。結果30株細菌5次凍融均復活成功，且其生物學(xué)特性及耐藥譜未發(fā)生明顯的變化，證實(shí)多次凍融對細菌的保存無(wú)影響。

 

　　4.與半固體菌種保存法的比較：用鑒定卡和半固體菌種培養基同時(shí)保存12株臨床分離菌及3株ATCC25922、ATCC25923、ATCC27853標準菌株6個(gè)月對照，其中半固體中的菌株定時(shí)轉種傳代。結果兩種方法保存菌株的生物學(xué)特性均一致。

 

　　三、討論

 

　　菌株保存得不成功容易引起菌株的生物學(xué)特征改變，甚至是耐藥質(zhì)粒的丟失而改變細菌的耐藥譜，某些敏感菌株與抗生素結合位點(diǎn)發(fā)生突變而形成耐藥［2，3］。根據對258張VITEK生化卡的凍融復活再分析，使我們成功地找到一種利用廢棄的VITEK鑒定卡作為臨床分離菌株的菌種保存方法，既不需要特殊設備，又不受反復轉種影響，因而其生物學(xué)特性不易發(fā)生變異，細菌的耐藥譜也基本保持不變。

 

　　隨著(zhù)全自動(dòng)微生物分析儀的普及應用，該方法可適合于常規工作的大量菌種保存的應用。對VITEK生化卡內的細菌反復凍融5次，分離出的細菌效果是相同的，證實(shí)保存在生化卡上的菌種可進(jìn)行多次復活利用，為了保證每次都能成功地復蘇獲得菌株，我們通過(guò)試驗發(fā)現，生化卡上的試驗小孔除陽(yáng)性控制小孔外，其它糖類(lèi)發(fā)酵孔內的細菌均能復活成功，其結果無(wú)差異。由于快速復溫對細菌的損傷力�。�4］，為了保證菌株獲得最大的成活率，我們認為對鑒定卡復融應采取由-20直接放35℃孵箱。

作者：孫明洪　陳麗英　呂火祥　劉建棟　沈蓓瓊　俞曉潔 《中華醫學(xué)檢驗雜志》

　　參考文獻

 

　　1，張秀珍，主編. 當代細菌檢驗與臨床. 北京：人民衛生出版社,1999. 401-446.

　　2，Chambers HF, Sachdeva MJ, Hackbarth CJ. Kinetics of pencilin binding to penicillin-binding proteins of Stophylococcus aureus. Biochem J, 1994,301:885-891.

　　3，王清濤，杜小玲，曲壽山，等. 金黃色葡萄球菌耐藥性分析. 中華醫學(xué)檢驗雜志，1997,20:275.

　　4，章崧英，王澤時(shí)，鄭斯通，主編. 實(shí)用低溫學(xué). 北京：科學(xué)出版社，1994.73-77.