幽門(mén)螺桿菌實(shí)驗室檢測與應用價(jià)值

【關(guān)鍵詞】  幽門(mén)螺桿菌；方法學(xué)；應用價(jià)值

 

　　1983年由澳大利亞醫生R·Warren和B·Marshall從胃黏膜組織中成功分離培養出幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)以來(lái),Hp與慢性活動(dòng)性胃炎和消化性潰瘍以及在發(fā)病過(guò)程中的作用已得到證實(shí)。但Hp感染缺乏臨床表現特征，Hp感染診斷主要依靠實(shí)驗室檢測。Hp檢測技術(shù)日益完善和準確，方法從細菌形態(tài)學(xué)發(fā)展進(jìn)入到Hp全基因序列測定分析階段。Hp感染檢測方法可分為：取胃黏膜標本檢測Hp，包括細菌培養、快速尿素酶試驗、組織涂片和切片染色；呼氣試驗和尿氨排出試驗檢測Hp；血清免疫學(xué)方法檢測Hp。根據檢測是否需做胃鏡檢查分為：直接檢測法，必須在胃鏡下取材，包括細菌培養、涂片染色、快速尿素酶試驗、活檢標本切片染色和多聚酶鏈反應等；間接檢測法，不需要胃鏡下取材，包括13 C、14 C呼氣試驗、15 N尿氨排出試驗和血清免疫學(xué)檢測等。Hp感染實(shí)驗室檢測的常用方法有：

 

　　1  微生物學(xué)方法

 

　　1.1  細菌培養法  從胃黏膜活檢標本中分離培養出Hp，再用形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方法鑒定，是診斷Hp感染最可靠的方法。Hp是微需氧菌，不能在大氣下和絕對厭氧條件下生長(cháng)，它需要的氣體條件是N2 85%、CO2 10%、O2 5%，還需要有一定的濕度和較好的營(yíng)養成分。Hp生長(cháng)緩慢，形成的菌落細小，必須添加抑制雜菌生長(cháng)的抗生素，才能提高Hp的檢出率。盡管Hp感染診斷的金標準是分離培養，但它需要一些特殊設備和試驗條件，國內尚未廣泛開(kāi)展，至今只有少數實(shí)驗室把它用于科研，而不作為常規檢測而用于臨床。

 

　　1.2  涂片檢測法  在胃鏡檢查時(shí)用細胞刷在胃黏膜表面刷取黏液成分或取活檢標本直接涂片，經(jīng)革蘭(Grams)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，Hp呈Grams陰性，彎曲狀、弧狀、S形和C形，形態(tài)特征較明顯。涂片檢測Hp是一種簡(jiǎn)單實(shí)用的方法,涂片標本未經(jīng)任何處理不受外界因素影響，菌體保持完整，形態(tài)與生活時(shí)相仿。為簡(jiǎn)便染色過(guò)程,Grams染色亦可簡(jiǎn)化為石碳酸復紅單染法［1］，染色效果不比Grams染色遜色。還可采用相差顯微鏡直接觀(guān)察涂片檢測Hp和用吖啶橙染色，熒光顯微鏡觀(guān)察檢測Hp。

 

　　2  快速尿素酶試驗

　　

　　Hp產(chǎn)生尿素酶的能力強，尿素酶分解胃液中尿素生成NH3和CO2，快速尿素酶試驗用于胃鏡檢查中診斷有無(wú)Hp感染。試驗試劑包括尿素、pH指示劑(酚紅)、緩沖液和防腐劑。在酸性條件下，當pH值≤6.8時(shí)，酚紅指示劑呈黃褐色，如果活檢標本中有Hp存在，尿素酶分解尿素產(chǎn)生NH3使試劑pH值發(fā)生變化而升至≥8.4，這時(shí)酚紅指示劑由黃褐色變?yōu)榧t或紫紅色。目前常用的尿素酶試劑在與胃鏡活檢標本接觸后幾分鐘后便可顯色，快速尿素酶試驗屬于間接試驗，標本大小、細菌多少、反應時(shí)間、溫度和濕度均可影響尿素酶試驗結果。尿素酶試驗具有快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，特別適合基層醫院推廣使用。

 

　　3  同位素示蹤劑方法

　　

　　這類(lèi)方法主要是采用讓患者口服同位素標記的尿素，利用Hp產(chǎn)生尿素酶能分解尿素的原理，以觀(guān)察胃中Hp分解尿素的能力，以此判斷患者是否感染了Hp及感染的程度，這類(lèi)試驗現有兩類(lèi)三種。Hp具有較強的內源性尿素酶，能分解胃內及核素標記的尿素，產(chǎn)生CO2和NH3,CO2被吸收后經(jīng)肺呼出，分析呼氣中的13 CO2或14 CO2即可診斷Hp的存在。根據呼氣試驗類(lèi)似的原理，15 N尿氨排出試驗是一種尿素在胃內分解后，15 N經(jīng)吸收通過(guò)腎臟由尿排出的試驗，讓受試者口服穩定性同位素15 N標記的尿素，然后測定尿液中排出的15 NH3來(lái)判斷胃內Hp的感染情況。這類(lèi)試驗方法屬于間接檢測，通過(guò)多次采集樣本后在儀器上進(jìn)行測定分析。

 

　　3.1  呼氣試驗  呼氣試驗的原理是基于Hp產(chǎn)生大量的尿素酶，給感染Hp的患者口服同位素標記尿素溶液，則尿素被分解后產(chǎn)生同位素標記CO2由肺呼出�？墒占�呼氣樣本，用氣體同位素質(zhì)譜儀或液體閃爍掃描儀檢測同位素標記CO2的量來(lái)檢測Hp。根據標記物的不同，分為13 C和14 C呼氣試驗。

 

　　3.1.1  13 C標記的尿素  用穩定性同位素13 C標記的尿素，讓患者口服后，尿素在胃中與Hp產(chǎn)生的尿素酶接觸后分解成13 CO2，測定其在總呼出量中所占的濃度，以判斷胃中是否感染了Hp和感染程度。這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是：體內測定胃內感染Hp的總體情況，避免了活檢標本Hp分布不均造成的假陰性的結果；13 C是一種穩定性同位素，對機體無(wú)損傷；它除了定性以外，還可做定量測定。它的最大缺點(diǎn)是需用高精度氣體比值同位素質(zhì)譜儀來(lái)測定，這種設備是一般醫院不具備的貴重儀器。

 

　　3.1.2  14 C標記的尿素  用14 C標記的尿素讓患者口服，用閃爍掃描儀測定患者呼出的14 CO2，這種儀器在有核醫學(xué)科的醫院一般都有，測定方法比較方便。盡管它的優(yōu)點(diǎn)類(lèi)似于13 CO2呼氣試驗，但是14C是一種放射性同位素，因此這項試驗對孕婦和小孩不宜使用。

 

　　3.2  尿氨排出試驗  15 N尿氨排出試驗是根據類(lèi)似呼氣試驗原理創(chuàng )立的，其方法是用15 N標記尿素讓患者口服，然后收集2 h尿液檢出其15 N尿氨的排出率，以判斷胃內Hp感染程度。這一試驗具有13 CO2呼氣試驗同樣的優(yōu)點(diǎn)，不需作胃鏡，無(wú)放射性損傷，采集樣本比呼氣試驗方便，測定準確性較高，缺點(diǎn)與13 C呼氣試驗相同，檢測需用氣體同位素質(zhì)譜儀。由于15 N尿氨排出試驗是一種尿素在胃內分解后，15 N經(jīng)吸收通過(guò)腎臟由尿排出的試驗，因此有嚴重肝腎功能損害者不宜使用。

 

　　4  血清學(xué)方法

　　

　　通過(guò)血清中Hp抗體測定Hp感染的方法比較多，有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、乳膠凝集試驗、免疫印跡試驗和細菌凝集試驗等，尤其以ELISA試驗應用最廣泛。Hp感染后會(huì )激發(fā)機體產(chǎn)生特異性體液免疫，血清中出現IgG、IgA、IgM抗體，常采用ELISA試驗檢測Hp IgG抗體。ELISA試驗是目前常用的方法，同時(shí)測定兩種免疫球蛋白能提高這一方法的敏感性。在進(jìn)行ELISA試驗時(shí)，最重要的是抗原選擇，該試驗的敏感性雖高，但缺乏特異性，從而影響對試驗結果的判斷。要提高ELISA試驗的特異性和敏感性，則需要對抗原進(jìn)一步純化，抗原則可獲得較高的特異性和敏感性。血清學(xué)方法簡(jiǎn)便，成本較低，患者對采血進(jìn)行檢測的方法比做胃鏡檢查更樂(lè )意接受。由于抗Hp抗體可長(cháng)時(shí)間維持在陽(yáng)性水平，至少需要6個(gè)月～12個(gè)月才能降到足以預測治療成功的程度，血清學(xué)方法便失去了原有的吸引力，但在流行病學(xué)調查中仍有它的應用空間。

 

　　5  多聚酶鏈反應

　　

　　多聚酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)實(shí)際上是一種核酸片段體外擴增試驗。做試驗的先決條件是首先必須清楚某一基因的核苷酸序列，然后人工合成其中兩個(gè)特異性片段作為引物，在PCR儀上經(jīng)過(guò)30個(gè)～50個(gè)循環(huán)擴增其核酸片段，使其成倍增長(cháng)，然后取其片段作瓊脂糖凝膠電泳，電泳后取出凝膠在紫外線(xiàn)燈下觀(guān)察結果，即可判斷所得產(chǎn)物是否為基因產(chǎn)物。目前亦可用這一反應來(lái)檢測標本中有無(wú)Hp的存在，甚至還可進(jìn)一步用核苷酸序列分析或特異性探針加以鑒定�？墒荘CR高敏感性也有它致命的弱點(diǎn)，使用試劑濃度、操作溫度、過(guò)度擴增、極少DNA污染等都可導致假陽(yáng)性。嚴格控制，合理選擇DNA擴增循環(huán)次數，防止污染，設置對照等都是不可忽視的因素。采用PCR技術(shù)在Hp診斷和評價(jià)治療后根治效果有意義，但對實(shí)驗室和試驗條件要求高，如果在非標準條件下進(jìn)行檢測，有可能會(huì )出現懸殊的結果，特別是假陽(yáng)性的大量出現。目前PCR技術(shù)不適合用于臨床檢測Hp感染。

 

　　6  組織切片染色法

 

　　6.1  胃黏膜活檢標本  病理組織切片染色檢測Hp是最常用的方法，活檢標本經(jīng)石蠟包埋切片染色后，Hp在顯微鏡下形態(tài)特征是菌體2 μm～4 μm長(cháng)，0.5 μm寬，Hp為弧形成螺旋狀彎曲樣細菌，定植于胃黏膜上皮細胞表面、胃小凹和胃內腺腔中，常規HE染色憑Hp形態(tài)及定植部位可以識別。當Hp量少或有上皮細胞脫落時(shí)而難以辨認時(shí)，就需要采用其他組織化學(xué)染色方法來(lái)鑒別診斷，迄今沒(méi)有一種染色方法對Hp的顯示是特異的。顯示Hp的染色方法有：改良Warthin-Starry銀染色、改良Giemsa、堿性品紅、石碳酸復紅、亞甲藍、中性紅、甲苯胺藍、甲基紫、甲苯酚紫和吖啶橙染色等10余種染色法。改良Warthin-Starry銀染色是經(jīng)典的Hp染色方法［2］，Hp在黃色背景下呈現出黑色螺旋狀形態(tài)，該染色方法技術(shù)要求高，操作繁瑣，每次染色需加溫、恒溫及配顯影液，熱水沖洗等，若操作不當容易造成在切片上留下銀顆粒沉淀與Hp橫截面形態(tài)相混淆的現象；改良Giemsa染色是一步雙色快速染色法，操作更為簡(jiǎn)便，染色效果好，現已廣泛應用于常規檢測和科研中［3］，在顯微鏡下Hp染成淡藍色，菌體形態(tài)清楚，切片背景清晰，不但可觀(guān)察到Hp數量、侵入深度和分布情況，還能觀(guān)察到胃黏膜病理改變情況等；堿性品紅、石碳酸復紅、亞甲藍、中性紅、甲苯胺藍、甲基紫、甲苯酚紫染色都是單染法，操作簡(jiǎn)便，染色時(shí)間短，菌體形態(tài)和切片背景呈一色性，當細菌量少時(shí)應與黏液成分認真區分；吖啶橙熒光染色，Hp呈淡橙紅色熒光，可以更好地辨別Hp的形態(tài)特征，尤其在Hp量少時(shí)優(yōu)于Warthin-Starry和Giemsa染色，吖啶橙熒光染色簡(jiǎn)便、快速，但需要熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察；熒光抗體免疫組織化學(xué)方法也有人使用，不比組織化學(xué)染色方法有更多的優(yōu)點(diǎn)。

 

　　6.2  Hp形態(tài)分布情況  通過(guò)組織化學(xué)染色顯微鏡下觀(guān)察，Hp呈單個(gè)散在或成團聚集，形態(tài)以螺旋狀、彎曲桿狀、球狀菌最常見(jiàn)，Hp在生存環(huán)境不利時(shí)易發(fā)生形態(tài)變異，球形變常見(jiàn)，短桿狀、長(cháng)絲體、巨球體等形態(tài)亦可見(jiàn)到。根據Hp數量和分布密度進(jìn)行半定量測定，將Hp感染分為4級：(-)：無(wú)特征性細菌；(+)：仔細尋找有細菌發(fā)現，數量較少，稀疏散在；(++)：有大量散在分布或成叢的細菌,數量較多，比較密集；(+++)：有大量的細菌，數量很多，聚集成團。Hp感染檢測方法應本著(zhù)經(jīng)濟、快速、準確、簡(jiǎn)便、敏感、特異等原則，盡可能選擇最佳方法，以便實(shí)施和推廣。通過(guò)胃鏡檢查所取標本進(jìn)行快速尿素酶試驗和病理組織切片Giemsa染色檢測Hp，是目前各級醫院診斷Hp感染最常用的檢測方法。

作者：胥維勇，楊 紅，楊 群，范小莉，何 娟 作者單位：四川省人民醫院，四川 成都 610072

【參考文獻】

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　�。�2］ 凌啟波.實(shí)用病理特殊染色與組化技術(shù)［M］.廣東高等教育出版社,1989:4245.

　�。�3］ 楊紅,胥維勇,李科,等.改良Giemsa染色在幽門(mén)螺桿菌檢測的應用［J］.中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志,1996，5(1):101.