大腸菌群快檢紙片法在現場(chǎng)中的應用

【摘要】  目的 了解大腸菌群快檢紙片法在現場(chǎng)中的應用情況。方法 根據快檢紙片說(shuō)明要求對待檢樣品進(jìn)行測試分析。結果菌量的多少對結果判定有一定的影響，粘貼法和涂抹擦拭法對結果無(wú)明顯的影響。結論 只有掌握了實(shí)驗各環(huán)節的諸多因素，才能綜合判定出所測結果。

 

【關(guān)鍵詞】  大腸菌群；快檢紙片；分析

 

 

    大腸菌群主要來(lái)源于人與動(dòng)物的腸道，是食品及水受污染的主要細菌衛生學(xué)指標。目前在檢測方法上大多數的待檢樣品依然采用傳統的發(fā)酵法，由于該法可適用于各類(lèi)樣品的檢測，操作較為繁瑣復雜，且時(shí)間長(cháng)，耗費大。而大腸菌群快速檢測紙片法（以下簡(jiǎn)稱(chēng)快檢法）除了具有與發(fā)酵法相同的特異性及敏感性外，還具有經(jīng)濟、簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)。已在各地推廣并使用，簽于快檢法采樣的局限性，近年來(lái)我們僅對本市、區的餐（飲）具消毒質(zhì)量進(jìn)行了監督檢測，在全程檢測中我們對結果的判斷和可能出現的疑問(wèn)以及與試驗操作方法的吻合性進(jìn)行了對比后發(fā)現了一些問(wèn)題，有了一些思索，結合現場(chǎng)應用實(shí)踐和基層提出的問(wèn)題，我們提出以下想法僅供同行借鑒。

 

    1  快檢法在顏色判定上存在的問(wèn)題

 

    從原理上說(shuō)，大腸菌群的細菌都是發(fā)酵乳糖的，快檢法是將一定量的乳糖、指示劑（溴甲酚紫和TTC）以及營(yíng)養成分等吸附于一定面積的無(wú)菌濾紙上，當細菌生長(cháng)繁殖時(shí)，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使pH值降低，溴甲酚紫指示劑由藍色變黃色，此時(shí)產(chǎn)酸后的檢樣在紙片上呈現出黃色反應，同時(shí)含有的脫氫酶在適宜的pH范圍內，可將相應的作用物脫氫，脫下的 氫還原TTC形成紅色的不溶性三苯甲替。即又可在產(chǎn)酸后的黃色背景前提下顯示出紅色斑點(diǎn)（或紅暈）。這一特點(diǎn)是快檢法的典型特性。許多同行也以此特性作為陽(yáng)性結果的唯一判斷依據。但在實(shí)際檢測中由于檢樣的不同以及許多不固定因素，在顏色的梯度上會(huì )出現一些難以判斷的不定結果，我們具體歸納以下幾點(diǎn)。

 

    1.1  不發(fā)酵乳糖細菌對顏色的反應  由于腸桿菌科有許多不發(fā)酵乳糖的其他細菌，此時(shí)如果無(wú)菌濾紙上吸附有一定面積養分并稍具備適宜細菌生長(cháng)繁殖要求的營(yíng)養成分，這類(lèi)不發(fā)酵乳糖的菌就會(huì )在該紙片上以菌落生長(cháng)形式呈現出紅色斑點(diǎn)特征。由于此類(lèi)菌不發(fā)酵乳糖，周?chē)�也就不�?huì )變黃色反應。又因為大腸菌群都是一類(lèi)發(fā)酵乳糖的細菌。所以此時(shí)應考慮為大腸菌群以外的腸道菌，而不能誤認為大腸菌群的細菌而定假陽(yáng)性。由于大腸菌群的限定，該結果應列為陰性結果的范疇。

 

    1.2  菌量的多少對顏色的反應  在進(jìn)行任何細菌檢驗時(shí)，菌量的多少一直都是個(gè)焦點(diǎn)問(wèn)題，不可忽視。我們認為在快檢法中，菌量多少與結果密切相關(guān)。當目的菌多時(shí)，大量的乳糖分解后使紙片產(chǎn)酸變黃色，同時(shí)使得酶的活性受到抑制，無(wú)法還原TTC，而不能形成紅色斑點(diǎn)或紅暈，此時(shí)的結果是紙片變黃。同樣如菌量適中時(shí)，乳糖分解產(chǎn)酸整個(gè)紙片變黃色后，酶活性經(jīng)過(guò)氧化還原反應后又形成紅色斑點(diǎn)，此時(shí)紙片上在黃色背景下顯示出的紅色斑點(diǎn)（或紅暈）即為典型的陽(yáng)性結果。當菌量較少時(shí)，紙片上的每個(gè)菌落可形成一個(gè)紅色小斑點(diǎn)，而且周?chē)�變黃色，顯示出色彩鮮明的典型陽(yáng)性結果。但如果所試樣品紙片變黃色而無(wú)紅色斑點(diǎn)（或紅暈）時(shí)，應考慮是否菌量多而抑制了斑點(diǎn)的形成，嚴格地說(shuō)這種結果也應直接判為陽(yáng)性。必要時(shí)可以補加發(fā)酵法做證實(shí)試驗，以避免誤判。

 

    1.3  培養時(shí)間對顏色的反應  國家標準規定，采樣后的快檢紙片，應放置(37±1)℃培養16～18h后觀(guān)察結果。如培養時(shí)間過(guò)長(cháng)，生化反應不同的細菌因分解蛋白胨產(chǎn)堿，可使紙片由黃色變?yōu)榛液稚�（V-P陽(yáng)性菌），影響結果判定。我們在工作中將檢樣紙片在限定時(shí)間內進(jìn)行觀(guān)察后繼續放置至24h觀(guān)察，未發(fā)現有明顯的變化。因此在結果判定上培養時(shí)間雖不是絕對而言，但為了控制V-P陽(yáng)性菌的結果，時(shí)間最好限定在同一個(gè)范圍內。以避免誤判。有人建議新鮮食品或未經(jīng)加工處理的食品(36±1)℃培養18～20h，冷凍、干燥或含有防腐劑的食品應培養20～24h為宜。但在高溫季節應將采樣后放置時(shí)間和路徑的時(shí)間計算在內。以減少誤差。

 

    1.4  操作方法對顏色的反應  大腸菌群紙片法現場(chǎng)快速檢測時(shí)，方法雖簡(jiǎn)單，但對基層的同行來(lái)說(shuō)存在一些誤區，我們在現場(chǎng)對食（飲）具用紙片粘貼和涂抹擦拭后進(jìn)行培養，以區別因工作人員的操作不一造成的誤判，進(jìn)行比較后發(fā)現，只要是陽(yáng)性的檢樣，無(wú)論是兩種方法中的哪種，均可出現同一種陽(yáng)性結果。所不同的是陽(yáng)性的程度差異而已。在定性上無(wú)明顯區別。

 

    2  保存條件對快檢紙片的影響

 

    為了避免操作中造成的誤差，在實(shí)際工作中應對結果的判定和理解以及紙片保存等各方面進(jìn)行全面掌握，由于紙片受貯存環(huán)境和外界因素影響可引起變質(zhì)，正確的保存方法對確保其質(zhì)量至關(guān)重要。最好將快檢紙片放置在溫度<20℃環(huán)境下保存，≤10℃的環(huán)境保存最宜，干燥、避光、通風(fēng)更有利于快檢紙片pH值的穩定。以上環(huán)境下保存可持續使用2年。酸堿物質(zhì)可直接影響快檢紙片pH值的測定，因此嚴禁與酸堿物質(zhì)同放一處。如在未檢前變黃色即為失效，不可再用。我們在現場(chǎng)進(jìn)行檢測時(shí)常選用的快檢紙片規格為5cm×5cm，每次試驗用2張，共50cm2 。主要用于物體表面大腸菌群的檢測。對快檢紙片的外觀(guān)也應進(jìn)行觀(guān)察，內包裝以及色澤等感觀(guān)指標也應絕對符合質(zhì)控要求。

 

    3  結果判定及分析

 

    綜合以上檢測我們認為任何一種試驗都有它的綜合因素，我們只有考慮了眾多因素并控制了該因素后，才有可能完成它，因此我們對快檢法的應用和結果判定上歸納總結以下幾點(diǎn)提供于基層參考應用。

 

    3.1  陽(yáng)性結果  （1）紙片上呈現紅色斑點(diǎn)（或紅暈），而且其周?chē)�均變�(yōu)辄S色，此結果為典型的陽(yáng)性結果。（2）紙片中某些部分變黃色，有或無(wú)紅色斑點(diǎn)（或紅暈）時(shí)，此結果也應判為陽(yáng)性。

 

    3.2  陰性結果  (1)紙片整個(gè)保持原藍紫色或藍紫色加深，此結果應判為典型的陰性結果。(2)紙片保持藍紫色，但其中出現紅色斑點(diǎn)或紅暈，而周?chē)�不變黃色，此結果也應判為陰性（此結果最易誤判為陽(yáng)性）。

 

    3.3  可疑待證實(shí)后出具的結果  (1)紙片在限定培養溫度及時(shí)間內全變黃色（該界線(xiàn)要與采樣后立即變黃色者區分），此結果也應判為可疑陽(yáng)性。應按發(fā)酵法做證實(shí)試驗，以避免誤判。(2)紙片采樣后立即變黃色者，說(shuō)明檢樣呈酸性狀態(tài)，不易用該紙片法進(jìn)行監測。此情況易誤判為陽(yáng)性�？筛挠脗鹘y的發(fā)酵法完成。

 

    3.4  其他不定因素的結果分析  現場(chǎng)中采用平行樣檢驗主要是為了預防試驗中結果的準確性和漏檢、漏判等試驗誤差。有時(shí)在結果判斷時(shí)也可出現平行樣紙片不相同的反應，大多數情況下結果還是相互吻合的，只是反應量多少而異，因為該檢測標準不是一個(gè)估計值的標準，而是不可檢出的指標，所以只要某一方陽(yáng)性應傾向于該方或進(jìn)一步發(fā)酵法完成。

 

    另外操作時(shí)也要注意水分的控制，水分過(guò)多致使菌細胞懸浮似液體培養狀態(tài)，此時(shí)菌落的形成也不易完成。操作時(shí)應以整個(gè)紙片濕潤而又不滴水為宜，不可放在水中長(cháng)時(shí)浸泡。

 

    大腸菌群主要來(lái)源于人畜糞便，通過(guò)此項檢測可以間接的說(shuō)明樣品是否被糞便污染，因此將它作為細菌衛生學(xué)常用的重要指標。目前大腸菌群檢測在各類(lèi)食品及衛生細菌學(xué)檢驗中均被列為必檢項目，快檢法在衛生細菌學(xué)檢測中也被廣泛應用［1～5］，作為食（飲）具衛生消毒效果大腸菌群檢測的法定方法之一，并列入了國家標準GB14934-94［6，7］。1998年又將快檢紙片法納入公共場(chǎng)所衛生監測規范。為了促進(jìn)我國大腸菌群檢測紙片質(zhì)量的標準化，許多學(xué)者對此進(jìn)行過(guò)質(zhì)量標準研究。對紙片快速檢測法予以充分研究［8］。綜合我們對試驗原理分析和結果判定，我們認為，一種好的試驗方法，只有共同完善，取之長(cháng)處，才有發(fā)揮前景，在此我們將粗淺的認識和微薄感想提供于同行，希望能得到認可，不足之處愿與共勉。

作者：阿衣夏木，高 濤，劉 艷，于 烽，遠雪梅    作者單位：830011 新疆烏魯木齊，新疆維吾爾自治區疾病控制中心

 

【參考文獻】

  1 林奕華.1996～1997年食具衛生質(zhì)量調查.中國衛生檢驗雜志,1999，9（4）：290.

2 肖紹昌. 臨夏地區餐（飲）具消毒質(zhì)量與對策.職業(yè)與健康,1999，15（8）：27.

3 劉世強.清流縣城區餐具消毒質(zhì)量調查分析.職業(yè)與健康,1999，15（8）：27.

4 邢業(yè)蘭.食品用TTC紙片測定飲用水大腸菌群初探.中國衛生檢驗雜志,1998，8（5）：291.

5 朱憶.大腸菌群快速紙片法檢測醬肉的結果評價(jià)與分析.中國檢驗雜志,1998，8（5）：305.

6 國家技術(shù)監督局.食（飲）具消毒方法.中華人民共和國GB14934-94.

7 孟昭赫.食品衛生檢驗方法注解.北京：人民衛生出版社,1990，48-82.

8 任澤萍,段發(fā)愚,李京,等.大腸菌群檢測紙片質(zhì)量標準研究.中國衛生檢驗雜志,2000,10(1):28.