耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性分析

【摘要】  目的：分析耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)檢測方法及其耐藥性。方法：采用頭孢西丁紙片法和PCR兩種方法檢測臨床分離的60株金黃色葡萄球菌中MRSA菌株;紙片擴散法測定金黃色葡萄球菌對15種抗菌藥物的敏感性。結果：紙片法及PCR法對MRSA檢出率分別為15%、13.3%,兩種方法對MRSA檢出率差異無(wú)統計學(xué)意義（P＜0.05）。以PCR法檢出mecA、femB基因為判斷MRSA的金標準。除了替考拉寧、萬(wàn)古霉素以外,其余抗生素的耐藥率MRSA組均明顯高于MSSA組(P<0.01)。結論：頭孢西丁紙片法是篩選和確認MRSA菌株的一種可靠、簡(jiǎn)便的方法;MRSA為多重耐藥菌株,臨床應加強檢測。

 

【關(guān)鍵詞】  耐甲氧西林;金黃色葡萄球菌,R4/E3C

 

　　Study on insecticide tolerance of Methicillin resistant Staphylococcus aureus

 

　　FANG Qiang

 

　　Department of Bioengineering, Changchun Industry University, Changchun 130012, China

 

    Abstract: Objective  To analyze differentiate of detecting Methicillin resistant Staphy lococeus aureus ( MRSA) and investigate the changes of antimicrobial susceptibility of staphylococcus aureus in order to guide a reasonable use of antibiotics. Methods  Sixty strains of S. aureus isolated from clinical specimens were tested for K-B to 15 antibiotics. Results   The isolate rate of K-B and PCR method was 15% and 13.3%,respectively, which there was not significant difference (P>0.05). The double-PCR was goaden criterion for MRSA. Except for Vancomyem and Teicoplanin , the susceptiblility of MRSA was lower than MSSA. Conclusion    K-B for Cefoxitin is a reliable and convenient method. Surveillance of the susceptibility of provincial S. aureus to antimicrobial agents is of great importance to both rational use of antibiotics and reduction of resistant strains.

 

    Key Words：Staphylococcus aureus; Susceptibility; Antimicrobial agents

 

    耐甲氧西林金黃色葡萄球菌目前已經(jīng)成為院內感染的主要病原菌，并逐漸擴展到社區，與艾滋病、病毒性乙型肝炎并列成為世界三大感染性疾病，嚴重威脅著(zhù)人類(lèi)的健康。及時(shí)準確的檢測MRSA，并合理應用抗菌素，采取嚴格的隔離和消毒措施，對于控制MRSA院內暴發(fā)流行，限制向社區蔓延是十分必要的。

 

　　1   材料與方法

 

　　1.1  菌株來(lái)源：為我研究中心收集的2005 年1 月～2005 年12 月吉林省人民醫院60 例住院患者各種細菌標本。MRSA 醫院感染的診斷按《臨床醫院感染學(xué)》確定［1 ］ 。質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、ATCC29213 均購自衛生部臨床檢驗中心。

 

　　1.2  抗生素紙片及培養基：抗生素紙片均購自北京天壇藥物生物技術(shù)公司;血瓊脂、巧克力瓊脂等平板購自天津賽凌科技服務(wù)有限公司;藥敏試驗的M - H 瓊脂平板由杭州天和微生物試劑有限公司提供的M - H 瓊脂粉按說(shuō)明要求溶解、滅菌、配制。

 

　　1.3  細菌鑒定：細菌的分離和培養按《全國臨床檢驗操作規程》(第2版) 進(jìn)行;細菌鑒定采用法國生物梅里埃API staph 鑒定系統和手工法。

 

　　1.4  MRSA株的檢測(采用K-B法)：在M-H瓊脂中加入2%～4%NaCl溶液,35℃,培養24h,采用較穩定的頭孢西丁紙片代替甲氧西林,如金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)≤19mm,判定為MRSA株。

 

　　1.5  mecA～femB雙重PCR體系及擴增條件［2］：94℃預變性4min，94℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸60s，進(jìn)行30次循環(huán)，最后72℃延伸2min，反應結束后，將PCR產(chǎn)物于4℃保存。mecA和femB基因擴增引物見(jiàn)表1，參照JonasD［3］等報道設計，由上海生物工程有限公司合成。表1  PCR擴增mecA和femB基因所用引物（略）

 

　　1.6  藥敏試驗：采用K-B法,其操作及結果判定按照美國國家臨床實(shí)驗室標準委員會(huì )(NCCLS)頒布的規則(2000年版)進(jìn)行［1］。

 

　　2  結果

 

　　2.1  K-B法檢測MRSA：60株金黃色葡萄球菌通過(guò)K-B法檢測MRSA，結果有9株為MRSA，51株為MSSA。

 

　　2.2  MRSA確證試驗：mecA～femB雙重PCR對K-B法檢測的9株MRSA進(jìn)行確證試驗，其中8株為MRSA，另一株為mecA陰性，femB陽(yáng)性，為MSSA。表2  mecA、femB基因在不同種類(lèi)葡萄球菌中的表達（略） 注：MRSA－苯唑西林耐藥的金黃色葡萄球菌；MSSA－苯唑西林敏感的金黃色葡萄球菌；MRSCoN－苯唑西林耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌；MSSCoN－苯唑西林敏感的凝固酶陰性葡萄球菌

 

　　2.3  對8株MRSA進(jìn)行藥敏試驗：結果如表3。表3  8株MRSA的耐藥情況（略）注：M：100bp DNA ladder marker；1：MRSA陽(yáng)性對照株（協(xié)和醫院細菌室提供）的PCR擴增產(chǎn)物；2：MSSA（ATCC25923）的PCR擴增產(chǎn)物；3-13：MRSA株的PCR擴增產(chǎn)物。

 

　　3  討論

 

    對MRSA的檢測，除檢驗科常用、快速的紙片擴散法外，根據文獻報道（原理見(jiàn)表2），還需要進(jìn)行mecA～femB雙重PCR確證試驗。本研究對K-B檢測的9株菌再次進(jìn)行確證試驗，結果發(fā)現其中1株為MSSA。

 

    MRSA的分離率與不同時(shí)期、不同地域及抗生素選擇壓力不同等多種因素有關(guān)，但總體來(lái)說(shuō)，呈緩慢上升趨勢。本研究調查的5家教學(xué)醫院中，MRSA平均分離率為53.9％，高于李家泰［4］于2000年～2001年對我國13家醫院監測的平均分離率（37.4％）。其中上海中山醫院MRSA分離率最高（79.5％），這與2004年汪復［5］教授等人對上海地區14家醫院監測的結果63.9％（56.0％～86.5％）接近；武漢最低（31.6％）；浙江與武漢接近，為35％，基本接近張紹銀［6］報道的結果（43.2％）。

 

    另外，MRSA的危害性更嚴重的表現在對多種藥物的多重耐藥性，特別是β－內酰胺酶陽(yáng)性的菌株，其耐藥頻率更高。表1中可以看出，MRSA對許多抗生素包括青霉素G、頭孢類(lèi)、大環(huán)內酯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、單一抗生素類(lèi)的慶大霉素、克林霉素等均表現為大于90％耐藥，對于常用抗生素利福平也有不同程度的耐藥，即使體外藥敏敏感，但治療效果不理想。唯獨萬(wàn)古霉素、替考拉寧對其有100％敏感。MSSA對青霉素也有90％以上耐藥，對紅霉素和克林霉素的敏感率也已經(jīng)降低至30％～60％，對奎諾酮類(lèi)抗菌藥物的敏感率已經(jīng)低于90％，對頭孢類(lèi)抗菌藥物還保持90％左右的敏感。由此可見(jiàn)，如果長(cháng)期大量的濫用抗菌藥物，即使是MSSA，耐藥譜也會(huì )逐漸擴大。所有金黃色葡萄球菌對萬(wàn)古霉素和替考拉寧仍表現為100％敏感。目前，萬(wàn)古霉素是治療MRSA感染的首選藥物。但是，一旦大量使用萬(wàn)古霉素，又有潛在的耐萬(wàn)古霉素菌株出現的可能。自2002年美國報道了第1株耐萬(wàn)古霉素的金黃色葡萄球菌以來(lái)，先后出現3株VRSA［7］。我國尚無(wú)耐萬(wàn)古霉素金葡菌的報道。如萬(wàn)古霉素對MRSA治療無(wú)效，那么后果不堪設想。

 

    總之，快速、準確的檢測MRSA，及時(shí)監測耐藥譜，對發(fā)生MRSA暴發(fā)流行的控制，知道臨床實(shí)踐具有重要意義。

作者：房強    作者單位：長(cháng)春工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，吉林 長(cháng)春 130012

 

【參考文獻】

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　�。�3］Berger Bachi B. Expression of resistance to methicillin［J］. Trends Microbiol, 1994,2:389.

　�。�4］李家泰，李 耘，王 進(jìn).中國醫院和社區獲得性感染革蘭陽(yáng)性球菌耐藥性監測研究［J］.中華醫學(xué)雜志，2003，83（5）：365.

　�。�5］德 妹，汪 復，張嬰元.2004年上海地區細菌耐藥性監測［J］.中國抗感染化療雜志，2005，5（4）：195.

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　�。�7］Fred C，Tenover，McDonald LC. Vancomycin－resistant staphylococci and enterococci：epidemiology and control［J］.Curr Opin Infect Dis,2005,18：300.