微生物檢驗常規鑒定技術(shù)

一、形態(tài)結構和培養特性觀(guān)察

 

1、微生物的形態(tài)結構觀(guān)察主要是通過(guò)染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結構（包括細胞壁、細胞膜、細胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進(jìn)行觀(guān)察，直觀(guān)地了解細菌在形態(tài)結構上特性，根據不同微生物在形態(tài)結構上的不同達到區別、鑒定微生物的目的。

 

2、細菌細胞在固體培養基表面形成的細胞群體叫菌落（colony）。不同微生物在某種培養基中生長(cháng)繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的細菌在一定條件下，培養特征卻有一定穩定性。，以此可以對不同微生物加以區別鑒定。因此，微生物培養特性的觀(guān)察也是微生物檢驗鑒別中的一項重要內容。

 

        1) 細菌的培養特征包括以下內容：在固體培養基上，觀(guān)察菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養中的表面生長(cháng)情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養基穿刺接種觀(guān)察運動(dòng)、擴散情況。

 

        2) 霉菌酵母菌的培養特征：大多數酵母菌沒(méi)有絲狀體，在固體培養基上形成的菌落和細菌的很相似，只是比細菌菌落大且厚。液體培養也和細菌相似，有均勻生長(cháng)、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長(cháng)，在條件適宜的培養基里，菌絲無(wú)限伸長(cháng)沿培養基表面蔓延。霉菌的基內菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無(wú)色，基內菌絲褐色。霉菌在固體培養表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。

 

二、生理生化試驗

 

　　微生物生化反應是指用化學(xué)反應來(lái)測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應常用來(lái)鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類(lèi)鑒定中的重要依據之一。

 

　　微生物檢驗中常用的生化反應有：

 

1、糖酵解試驗

 

　　不同微生物分解利用糖類(lèi)的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣�？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗。

 

　　試驗方法：以無(wú)菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養物少許，接種于發(fā)酵液體培養基管，若為半固體培養基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置36±1.0°C培養，每天觀(guān)察結果，檢視培養基顏色有無(wú)改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無(wú)氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽(yáng)性，若為半固體培養基，則檢視沿穿刺線(xiàn)和管壁及管底有無(wú)微小氣泡，有時(shí)還可看出接種菌有無(wú)動(dòng)力，若有動(dòng)力、培養物可呈彌散生長(cháng)。

 

　　本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進(jìn)行各種細菌的鑒別，因而每次試驗，常需同時(shí)接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍和An-drade指示劑。

 

2、淀粉水解試驗

 

　　某些細菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。

 

　　試驗方法：以18~24h的純培養物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個(gè)平板可分區接種，試驗數種培養物）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1°C培養24~48h，或于20°培養5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養表面，若為液體培養物，則加數滴碘試劑于試管中。立即檢視結果，陽(yáng)性反應（淀粉被分解）為瓊脂培養基呈深藍色、菌落或培養物周?chē)�出現無(wú)色透明環(huán)、或肉湯顏色無(wú)變化。陰性反應則無(wú)透明環(huán)或肉湯呈深藍色。

 

　　淀粉水解系逐步進(jìn)行的過(guò)程，因而試驗結果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養時(shí)間，培養基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時(shí)制備為妥。

3、V-P試驗

 

　　某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱(chēng)V－P（+）反應。

 

　　試驗方法：

 

　　1) O’Meara氏法：將試驗菌接種于通用培養基，于36±1°C培養48h，培養液1ml加O’Meara試劑（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動(dòng)試管1~2min，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，若4h內不呈現伊紅、即判定為陰性。亦有主張在48~50°C水浴放置2h后判定結果者。

 

　　2) Barritt氏法：將試驗菌接種于通用培養基，于36±1°C培養4天、培養液2.5ml先加入5°Cα萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動(dòng)2~5min，陽(yáng)性菌常立即呈現紅色，若無(wú)紅色出現，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，如2h內仍不顯現紅色、可判定為陰性。

 

　　3) 快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應的三糖鐵瓊脂斜面培養物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動(dòng)后放置5min，判定結果。不產(chǎn)酸的培養物不能使用。

 

　　本試驗一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細菌時(shí)，通用培養基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應省去或以氯化鈉代替。

4、甲基紅（Methyl Red）試驗

 

　　腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。

 

　　試驗方法：挑取新的待試純培養物少許，接種于通用培養基，培養于36±1°C或30°C（以30°C較好）3~5天，從第二天起，每日取培養液1ml，加甲基紅指示劑1~2滴，陽(yáng)性呈鮮紅色，弱陽(yáng)性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現陽(yáng)性或至第5天仍為陰性、即可判定結果。

 

　　甲基紅為酸性指示劑，pH范圍為4.4~6.0，其pK值為5.0。故在pH5.0以下，隨酸度而增強黃色，在pH5.0以上，則隨堿度而增強黃色，在pH5.0或上下接近時(shí)，可能變色不夠明顯，此時(shí)應延長(cháng)培養時(shí)間，重復試驗。

 

5、靛基質(zhì)（Imdole）試驗

 

　　某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來(lái)。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。

 

　　試驗方法：將待試純培養物小量接種于試驗培養基管，于36±1C培養24h時(shí)后，取約2ml培養液，加入Kovacs氏試劑2~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽(yáng)性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數滴，在接觸面呈紅色，即為陽(yáng)性。

 

　　實(shí)驗證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽(yáng)性反應，若先用二甲苯或乙醚等進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現紅色，因而結果更為可靠。

6、硝酸鹽（Nitrate）還原試驗

 

　　有些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。

 

　　試驗方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養物或瓊脂斜面培養物表面，立即或于10min內呈現紅色即為試驗陽(yáng)性，若無(wú)紅色出現則為陰性。

 

　　用α-萘胺進(jìn)行試驗時(shí)，陽(yáng)性紅色消退很快、故加入后應立即判定結果。進(jìn)行試驗時(shí)必須有未接種的培養基管作為陰性對照。α-萘胺具有致癌性、故使用時(shí)應加注意。

 

7、明膠（Gelatin）液化試驗

 

　　有些細菌具有明膠酶（亦稱(chēng)類(lèi)蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。

 

　　試驗方法：挑取18~24h待試菌培養物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點(diǎn)種于平板培養基。于20~22℃培養7~14天。明膠高層亦可培養于36±1℃。每天觀(guān)察結果，若因培養溫度高而使明膠本身液化時(shí)應不加搖動(dòng)、靜置冰箱中待其凝固后、再觀(guān)察其是否被細菌液化，如確被液化，即為試驗陽(yáng)性。平板試驗結果的觀(guān)察為在培養基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑，若為陽(yáng)性，10~20min后，菌落周?chē)鷳�出現清晰帶環(huán)。否則為陰性。

 

8、尿素酶（Urease）試驗

 

　　有些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導酶，因為不論底物尿素是否存在，細菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。

 

　　試驗方法：挑取18~24h待試菌培養物大量接種于液體培養基管中，搖均，于36±1℃培養10，60和120min，分別觀(guān)察結果�；蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面，不要到達底部，留底部作變色對照。培養2，4和24h分別觀(guān)察結果，如陰性應繼續培養至4天，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽(yáng)性。

 

9、氧化酶（Oxidase）試驗

 

　　氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素C氧化，然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應。

 

　　試驗方法：在瓊脂斜面培養物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴，陽(yáng)性者Kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色，Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍色。陰性者無(wú)顏色改變。應在數分鐘內判定試驗結果。

10、硫化氫（H2S）試驗

 

　　有些細菌可分解培養基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。

 

　　試驗方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養基中，沿管壁穿刺接種，于36±1℃培養24~28h，培養基呈黑色為陽(yáng)性。陰性應繼續培養至6天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營(yíng)養肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養基上空，以不會(huì )被濺濕為適度；用管塞壓住置36±1℃培養1~6天。紙條變黑為陽(yáng)性。

11、三糖鐵（TSI）瓊脂試驗

 

　　試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培養18~24h，觀(guān)察結果。

 

　　本試驗可同時(shí)觀(guān)察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來(lái)又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類(lèi)不被氧化，所以仍保持黃色。

 

12、硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力（SIM）瓊脂試驗

 

　　試驗方法：以接種針挑取菌落或純養物穿刺接種約1/2深度，置36±1℃培養18~24h，觀(guān)察結果。培養物呈現黑色為硫化氫陽(yáng)性，混濁或沿穿刺線(xiàn)向外生長(cháng)為有動(dòng)力，然后加Kovacs氏試劑數滴于培養表面，靜置10min，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性。培養基未接種的下部，可作為對照。

 

　　本試驗用于腸桿菌科細菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著(zhù)提高篩選功效。

 

三、血清學(xué)試驗

 

　　血清學(xué)反應是指：相應的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現肉眼可見(jiàn)的沉淀、凝集現象。在食品微生物檢驗中，常用血清學(xué)反應來(lái)鑒定分離到的細菌，以最終確認檢測結果。

 

　　血清學(xué)反應的一般特點(diǎn)：

 

　　1) 抗原體的結合具有特異性，當有共同抗原體存在時(shí)，會(huì )出現交叉反應。

 

　　2) 抗原體的結合是分子表面的結合，這種結合雖相當穩定，但是可逆的。

 

　　3) 抗原體的結合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當時(shí)，才能出現可見(jiàn)反應。

 

　　4) 血清學(xué)反應大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無(wú)嚴格界限。第一階段為抗原體特異性結合階段，反應速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應即可完畢，但不出現肉眼可見(jiàn)現象。第二階段為抗原體反應的可見(jiàn)階段，表現為凝集、沉淀、補體結合反應等。反應速度慢，需幾分、幾十分以至更長(cháng)時(shí)間。而且，在第二階段反應中，電解質(zhì)、PH、溫度等環(huán)境因素的變化，都直接影響血清學(xué)反應的結果。

 

　　習慣上將經(jīng)典的血清學(xué)反應分三種類(lèi)別：凝集反應、沉淀反應和補體結合反應。

 

1、凝集反應

 

　　顆粒性抗原（細菌、紅細胞等）與相應抗體結合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見(jiàn)的凝集現象，稱(chēng)為凝集反應（Agglutination reaction）。其中的抗原稱(chēng)為凝集原，抗體稱(chēng)為凝集素。在該反應中，因為單位體積抗體量大，做定量實(shí)驗時(shí)，應稀釋抗體。

 

　　1) 直接凝集反應

 

　　顆粒性抗原與相應抗體直接結合所出現的反應，稱(chēng)為直接凝集反應(Direct agglution reaction)。

 

　　a.玻片凝集法。是一種常規的定性試驗方法。原理是用已知抗體來(lái)檢測未知抗原。常用于鑒定菌種、血型。如將含有痢疾桿菌抗體的血清與待檢菌液各一滴，在玻片上混勻，數分種后若出現肉眼可見(jiàn)的凝集塊，即陽(yáng)性反應，證明該菌是痢疾桿菌。此法快速、簡(jiǎn)便，但不能進(jìn)行定量測定。

　　b.試管凝集法。是一種定量試驗方法。多用已知抗原來(lái)檢測血清中有無(wú)相應抗體及其含量。常用于協(xié)助診斷某些傳染病及進(jìn)行流行病學(xué)調查。如肥達氏反應就是診斷傷寒、付傷寒的試管凝集試驗。因為要測定抗體的含量，故將待檢查的血清用等滲鹽水倍比稀釋成不同濃度，然后加入等量抗原，37℃或56℃，2~4小時(shí)觀(guān)察，血清最高稀釋度仍有明顯凝集現象的，為該抗血清的凝集效價(jià)。

 

　　2) 間接凝集反應

 

　　將可溶性抗原（抗體）先吸附在一種與免疫無(wú)關(guān)的，顆粒狀微球表面，然后與相應抗體（抗原）作用，在有電解質(zhì)存在的條件下，即可發(fā)生凝集，稱(chēng)為間接凝集反應(Indirect agglutination)。由于載體增大了可溶性抗原的反應面積。當載體上有少量抗原與抗體結合。就出現肉眼可見(jiàn)的反應，敏感性很高。

 

2、沉淀反應

 

　　可溶性抗原與相應抗體結合，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物，稱(chēng)為沉淀反應（Precipitation）。反應中的抗原稱(chēng)為沉淀原，抗體為沉淀素。由于在單位體積內抗原量大，為了不使抗原過(guò)剩，故應稀釋抗原，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應的效價(jià)。

 

　　1) 環(huán)狀沉淀反應：是一種定性試驗方法，可用已知抗體檢測未知抗原。將已知抗體注入特制小試管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原與抗體對應，則在兩液界面出現白色的沉淀圓環(huán)。

 

　　2) 絮狀沉淀反應：將已知抗原與抗體在試管（如凹玻片）內混勻，如抗原抗體對應，而又二者比例適當時(shí)，會(huì )出現肉眼可見(jiàn)的絮狀沉淀，此為陽(yáng)性反應。

 

　　3) 瓊脂擴散試驗：利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內擴散，若抗原抗體對應，且二者比例合適，在其擴散的某一部分就會(huì )出現白色的沉淀線(xiàn)。每對抗原抗體可形成一條沉淀線(xiàn)。有幾對抗原抗體，就可分別形成幾條沉淀線(xiàn)。瓊脂擴散可分為單向擴散和雙向擴散兩種類(lèi)型。單向擴散是一種定量試驗�？捎糜诿庖叩鞍缀�量的測定。而雙向擴散多用于定性試驗。由于方法簡(jiǎn)便易行，常用于測定分析和鑒定復雜的抗原成分。

 

3、補體結合反應

 

　　補體結合反應(Complement fixation reaction)是在補體參與下，以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統的抗原抗體反應。補體無(wú)特異性，能與任何一組抗原抗體復合物結合而引起反應。如果補體與綿羊紅細胞、溶血素的復合物結合，就會(huì )出現溶血現象，如果與細菌及相應抗體復合物結合，就會(huì )出現溶菌現象。因此，整個(gè)試驗需要有補體、待檢系統（已知抗體或抗原、未知抗原或抗體）及指示系統（綿羊細胞和溶血素）五種成份參加。其試驗原理是補體不單獨和抗原或抗體結合。如果出現溶菌，是補體與待檢系統結合的結果，說(shuō)明抗原抗體是相對應的，如果出現溶血，說(shuō)明抗原抗體不相對應。此反應操作復雜，敏感性高，特異性強，能測出少量抗原和抗體，所以應用范圍較廣。