病毒感染的實(shí)驗室診斷（2）

二、病毒的分離與鑒定

 

(一)病毒的分離

 

病毒分離的一般程序見(jiàn)表80-3。

 

表80-3 病毒分離的一般程序

 

淋巴細胞培養(Lymphocyte culture) 正常成熟的淋巴細胞不經(jīng)特殊處理不能在體外傳代培養。然而EBV感染的B淋巴細胞卻能在體外持續傳代，這是病毒轉化細胞的例證，也是分離出EBV的標志。T淋巴細胞在加入T細胞生長(cháng)因子(IL-2)后可在體外培養，為研究人類(lèi)逆轉錄病毒(HIV、HTLV)提供了條件，HIV在T淋巴細胞培養物中增殖形成多核巨細胞。

 

2.動(dòng)物試驗 這是最原始的病毒分離培養方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接種途徑根據各病毒對組織的親嗜性而定，可接種鼻內、皮內、腦內、皮下、腹腔或靜脈，例如嗜神經(jīng)病毒(腦炎病毒)接種鼠腦內，柯薩奇病毒接種乳鼠(一周齡)腹腔或腦內。接種后逐日觀(guān)察實(shí)驗動(dòng)物發(fā)病情況，如有死亡，則取病變組織剪碎，研磨均勻，制成懸液，繼續傳代，并作鑒定。

 

3.雞胚培養 用受精孵化的活雞胚培養病毒比用動(dòng)物更加經(jīng)濟簡(jiǎn)便。根據病毒的特性可分別接種在雞胚絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黃囊、腦內或靜脈內，如有病毒增殖，則雞胚發(fā)生異常變化或羊水、尿囊液出現紅細胞凝集現象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分離培養；但很多病毒在雞胚中不生長(cháng)。

 

 

(二)分離病毒的鑒定

 

1.病毒在細胞內增殖的指征

 

(1)細胞致病作用(Cytopathogenic effect,CPE) 病毒在細胞內增殖引起細胞退形性變，表現為細胞皺縮、變圓、出現空泡、死亡和脫落。某些病毒產(chǎn)生特征性CPE，普通光學(xué)倒置顯微鏡下可觀(guān)察上述細胞病變，結合臨床表現可做出預測性診斷(表80-4)。免疫熒光(IF)法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)，細胞內的病毒或抗原可被熒光素標記的特異性抗體著(zhù)色，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)斑點(diǎn)狀黃綠色熒光，根據所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。

 

表80-4 病毒在細胞內增殖的指征

 

 

(2)紅細胞吸附現象(Hemadsorption phenomenon) 流感病毒和某些副粘病毒感染細胞后24-48小時(shí)，以細胞膜上出現病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動(dòng)物及人的紅細胞，發(fā)生紅細胞吸附現象。若加入相應的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制紅細胞吸附現象的發(fā)生，稱(chēng)為紅細胞吸附抑制試驗。這一現象不僅可作為這類(lèi)病毒增殖的指征，還可作為初步鑒定。

 

(3)干擾現象 (Interference phenomenon) 一種病毒感染細胞后可以干擾另一種病毒在該細胞中的增殖，這種現象叫干擾現象。前者為不產(chǎn)生CPE的病毒(如風(fēng)疹病毒)但能干擾以后進(jìn)入的病毒(如ECHO病毒)增殖，使后者進(jìn)入宿主細胞不再生產(chǎn)CPE。

 

2.病毒感染性的定量測定

 

空斑形成單位 (Plaque-forming unit ,PFU) 測定 這是一種測定病毒感染性比較準確的方法。將適當濃度的病毒懸液接種到生長(cháng)單層細胞的玻璃平皿或扁瓶中，當病毒吸附于細胞上后，再在其上復蓋一層溶化的半固體營(yíng)養瓊脂層，待凝固后，孵育培養。當病毒在細胞內復制增殖后，每一個(gè)感染性病毒顆粒在單層細胞中產(chǎn)生一個(gè)局限性的感染細胞病灶，病灶逐漸擴大，若用中性紅等活性染料著(zhù)色，在紅色的的背景中顯出沒(méi)有著(zhù)色的“空斑”，清楚可見(jiàn)。由于每個(gè)空斑由單個(gè)病毒顆粒復制形成，所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位(PFU)來(lái)表示。

 

(2)50%致死量(LD50)或50%組織細胞感染量(TCID50)的測定 本法可估計所含病毒的感染量。方法是測定病毒感染雞胚，易感動(dòng)物或組織培養后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸液作10倍連續稀釋?zhuān)�接種于上述雞胚，易感動(dòng)物或組織培養中，經(jīng)一定時(shí)間后，觀(guān)察細胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動(dòng)物發(fā)病而死亡等，經(jīng)統計學(xué)方法計算出50%感染量或50%組織細胞感染量，可獲得比較準確的病毒感染性滴度。

 

3.病毒形態(tài)與結構的觀(guān)察 病毒懸液經(jīng)高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負染及電子顯微鏡可直接觀(guān)察到病毒顆粒，根據大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學(xué)技術(shù)分析病毒核酸組成、基因組織構、序列同源性比較加以鑒定。

 

4.血清學(xué)鑒定 用已知的診斷血清來(lái)鑒定。補體結合試驗可鑒定病毒科屬；中和試驗或血凝搗蛋制試驗可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株，應結合臨床癥狀，檢材來(lái)源及流行季節等加以綜合分析，并應注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆，須用病人急性期與恢復期雙份血清作血清學(xué)試驗，血清抗體滴度有≥4倍以上增高，才有意義。