厚樸內生真菌的研究（Ⅰ）：菌種分離及其鑒定

摘要：從兩個(gè)不同來(lái)源的厚樸Magnolia officinalis Rehd. et Wils.的莖中，分離獲得內生真菌48株，經(jīng)顯微形態(tài)觀(guān)察，鑒定為1綱、3目、6科、16屬。不同來(lái)源的厚樸內生真菌的種群、數量及分布部位存在顯著(zhù)差異。

　　關(guān)鍵詞：厚樸；  內生真菌；  多樣性

　　Study on Endophytic Fungi in Magnolia officinalis Rehd. et Wils.（Ⅰ）:Isolation and Identification of Endophytic Fungi

　　　Abstract：48 strains of endophytic fungi were isolated from the stem of Magnolia officinalis Rehd. et Wils. They were morphologically identified belonging to 16 genera, 6 families, 3 orders and 1 class. The result of the experiment has shown that quantity, species and distributing of the endophytes varied in Magnolia officinalis Rehd. et Wils. of different habitat.

　　Key words：Magnolia officinalis Rehd. et Wils.；  Endophytic fungi；  Diversity

　　厚樸Magnolia officinalis Rehd. et Wils. 是著(zhù)名的川產(chǎn)道地藥材, 屬?lài)�家二級保護的珍惜瀕危藥用植物。用于濕滯傷中，脘痞吐瀉，食積氣滯，腹脹便秘，痰飲咳喘等病癥［1］。厚樸多以復方入藥，用量較大；而厚樸原植物生長(cháng)周期長(cháng)，曾出現厚樸資源匱乏，采用環(huán)剝技術(shù)確保進(jìn)行了枝皮剝除的植株能繼續生長(cháng)的方法來(lái)保存資源的現象�，F在厚樸雖已進(jìn)行大面積規�；�種植，但從長(cháng)遠觀(guān)點(diǎn)看，厚樸資源仍顯不足。植物內生真菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似化學(xué)成分這一特性在一定程度上可以緩解植物資源短缺問(wèn)題。厚樸內生真菌的研究未見(jiàn)報道。筆者對厚樸內生真菌進(jìn)行了菌株分離、鑒定等工作�，F將研究結果報道如下。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  來(lái)源 采集四川峨眉山唐山健康植株的枝條；四川都江堰市虹口鄉健康植株的枝條作為樣本。原植物經(jīng)鑒定為厚樸Magnolia officinalis Rehd. et Wils.。

　　1.1.2  培養基  PDA培養基（馬鈴薯培養基）（用于培養）、PDA培養基＋青鏈霉素混和液（用于分離）、查氏培養基（NaNO3，K2HPO4，KCl，MgSO4，FeSO4，蔗糖）（用于鑒別）、促孢培養基（KH2PO4，KNO3，MgSO4・7H2O，KCl ，淀粉，葡萄糖，蔗糖）（用于鑒別）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  內生真菌的分離用自來(lái)水將新鮮植物表面洗凈，稍干后切成適宜長(cháng)度的小段，在75％酒精中浸泡3～5 min，用無(wú)菌水沖洗3～4次，無(wú)菌濾紙吸干。然后用無(wú)菌刀片將組織表皮削去，分別取韌皮部、木質(zhì)部和髓部切成5 mm×5 mm×1 mm的小塊貼放于分離培養基上，置25～28℃恒溫箱中培養3～20 d，待培養基上各植物組織周?chē)�長(cháng)出菌絲后，采用尖端菌絲挑取法對所分離的內生真菌進(jìn)行純化，即得內生真菌。

　1.2.2  內生真菌的鑒定采用插片培養和點(diǎn)植法，對分離獲得的銀杏內生真菌進(jìn)行顯微形態(tài)特征的觀(guān)察、分類(lèi)鑒定。分類(lèi)檢索參照文獻［2,3］。

　　2  結果與討論

　　2.1  厚樸內生真菌種群多樣性分析 從厚樸中共分離出48株內生真菌，經(jīng)顯微形態(tài)觀(guān)察，鑒定為1綱、3目、6科、16屬。厚樸內生真菌種群組成見(jiàn)表1。

　　表1   厚樸內生真菌種群組成（略）

　　由表1可以看出，厚樸內生真菌在種類(lèi)上存在著(zhù)極其豐富的多樣性特征。在厚樸內生真菌中，從數量上看，以曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和鐮孢屬（Fusarium）為優(yōu)勢種群，包含菌株分別占總菌株數的31.3％，18.8％，14.6％。部分屬種代表性顯微形態(tài)特征參見(jiàn)圖1～6。

　　2.2  不同采集地點(diǎn)厚樸內生真菌的分布從不同地點(diǎn)采集的厚樸植株中均分離到了一定數量、不同類(lèi)群的內生真菌，表明內生真菌在厚樸體內廣泛存在。不同采集地的厚樸中內生真菌的優(yōu)勢菌群不同。其中，采集于峨眉山唐山的厚樸優(yōu)勢菌群為青霉屬（Penicillium）；采集于都江堰市虹口鄉的厚樸優(yōu)勢菌群為曲霉屬（Aspergillus）。結果見(jiàn)表2。

　　圖1  葡萄孢Botrytis sp.顯微特征（略） 

　　圖2  鐮孢菌Fusarium sp.顯微特征（略）

　　圖3 阜孢霉Papularia sp.顯微特征 （略）

　　圖4 膠帚霉Gliocladium sp.顯微特征（略）

　　圖5  曲霉Aspergillus sp.顯微特征 （略）

　　圖6  青霉Penicillium sp.顯微特征（略）

　　由表2可以看出，采集于峨眉山的厚樸植株中的內生真菌在種類(lèi)上較之采自都江堰者顯得豐富，兩地植株中分離出的內生真菌數量相當。鐮孢屬（Fusarium）為不同來(lái)源厚樸植株的共有菌群，而兩地植株的優(yōu)勢菌群也成為各自的特有菌群之一。

　　表2   不同采集地點(diǎn)厚樸內生真菌數量及種類(lèi)分布情況（略）

本次實(shí)驗從兩個(gè)不同來(lái)源的厚樸中共分離到48株內生真菌，經(jīng)鑒定為1綱、3目、6科、16屬，顯示出該植物內生真菌在種類(lèi)和數量上的多樣性。采自不同地點(diǎn)的厚樸植株內生真菌種群差異較為明顯，采集于峨眉山唐山的厚樸優(yōu)勢菌群為青霉屬（Penicillium），而采自都江堰市虹口鄉的厚樸優(yōu)勢菌群為曲霉屬（Aspergillus）。鐮孢屬（Fusarium）是不同來(lái)源厚樸植株的共有菌群。采集于峨眉山的厚樸植株中的內生真菌在種類(lèi)上較之采自都江堰者顯得豐富。我們認為這與采集地的具體環(huán)境及厚樸的樹(shù)齡有關(guān)。樹(shù)齡較長(cháng)的植株能夠提供給微生物一個(gè)相對較長(cháng)的與宿主之間的“磨合期”，使一些致病菌轉變成暫時(shí)不致病的內生菌，內生真菌的種類(lèi)也就相對較多。這再一次表明，植物內生真菌的數量和種類(lèi)與植物自身狀況及其所處環(huán)境密切相關(guān)。有關(guān)厚樸內生真菌中活性菌株的篩選研究，將在隨后的文章中給予報道。

作者：龐蕾， 嚴鑄云， 郭曉恒， 羅靜， 萬(wàn)德光  《時(shí)珍國醫國藥》

　　參考文獻：

　�。�1］  國家藥典委員會(huì ). 中國藥典，Ⅰ部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：176.

　�。�2］  魏景超. 真菌鑒定手冊［M］.上海：上�？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

［3］  H. L巴尼特，B. B亨特著(zhù)，沈崇堯譯. 半知菌屬圖解［M］.北京：科學(xué)出版社，1977

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