【摘要】 目的 了解克雷伯菌的耐藥性及產(chǎn)AmpC菌株同時(shí)產(chǎn)ESBLs藥敏的變化。方法 采用Vitek 60型和Vitek 32型、紙片擴散法(KB法)測定42株產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs克雷伯菌的藥敏結果，并與24株產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs克雷伯菌和138株不產(chǎn)AmpC酶但產(chǎn)ESBLs的克雷伯菌藥敏結果對比分析；采用PCR分析產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的AmpC基因型。結果 產(chǎn)AmpC不管是否產(chǎn)ESBLs的克雷伯菌對亞胺培南敏感，對其他抗生素均有不同程度的耐藥；單純產(chǎn)ESBLs時(shí)，第四代頭孢菌素如頭孢吡肟對其活性較好，但產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs時(shí)，令頭孢吡肟幾乎失去活性。肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs的20株菌中7株檢出blaDHA基因，占35%，1株檢出blaMIR基因，占5%。另外同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的20株肺炎克雷伯菌中100%檢出blaTEM基因，90%檢出blaCTXM1基因，100%檢出blaSHV基因，85%檢出blaDHA基因，15%檢出blaMIR基因，90%檢出不同的氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因。結論 克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶和同時(shí)產(chǎn)ESBLs的耐藥性比單純產(chǎn)AmpC酶的耐藥性更高、更顯著(zhù)；肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶的主要基因型為DHA，對同時(shí)存在2～6種不同類(lèi)型耐藥基因的克雷伯菌，碳青霉烯類(lèi)藥物亞胺培南的體外活性最好。
【關(guān)鍵詞】 克雷伯菌耐藥基因 AmpC ESBLs
ABSTRACT Objective To investigate the drug resistance of Klebsiella and the durg susceptibilitiy variation of ESBLs and AmpC simultaneouslyproducing stains. Methods The drug susceptibility of 42 AmpC and ESBLs producing Klebsiella were detected by KirbyBauer motheds, Vitek 60 and Vitek 32 method. And the results were compared with those of 24 Klebsiella producing AmpC but nonproducing ESBLs and those of 138 Klebsiella producing ESBLs but nonproducing AmpC. The genotypes of AmpC were identified by PCR. Results All AmpCproducing Klebsiella were susceptible to imipenem and different degree of resistance to other tested antibiotics. The fourth generation of cephlosporin such as cefepime had potent activities to Klebsiella, but had little activity against Klebsiella simultaneouslyproducing AmpC and ESBLs. Of 20 strains of Klebsiella producing AmpC but nonproducing ESBLs, 7 strains were detected blaDHA gene and 1 strain with blaMIR gene; blaTEMgenes were amplified in 20 strains (100%), blaCTXM1 genes were detected in 18 strains (90%), blaSHV genes were examined in 2 strains (10%), blaDHA genes in 17 strains (85%), blaMIR genes in 3 strains (15%) and three types of AMEsencoding genes were tested in 18 strains (90%). Conclusions The antimicrobial resisitant rates of Klebsiella simutaneoulyproducing AmpC and ESBLs are higher than that to Klebsiella producing AmpC but nonproducing ESBLs. The genotypes of Klebsiella producing AmpC are mainly DHA type. Imipenem is the first choice of the antibiotics against Klebsiella carrying 2～6 kinds of resistance genes in clinic.
KEY WORDS Klebsiella; Resisitance gene; AmpC; ESBLs AmpC
酶是由革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的能使包括第三代頭孢菌素在內的許多β內酰胺酶類(lèi)抗生素失活的頭孢菌素酶，既可由染色體介導，也可以由質(zhì)粒介導；產(chǎn)ESBLs酶是質(zhì)粒介導的能水解甲氧氨基β內酰胺抗生素如頭孢噻肟、頭孢他啶以及氨曲南的β內酰胺酶，它的主要類(lèi)型是TEM類(lèi)和SHV類(lèi)，分別由blaTEM1、blaTEM2和blaSHV1基因發(fā)生單個(gè)點(diǎn)突變或多個(gè)點(diǎn)突變，導致1個(gè)或多個(gè)氨基酸改變而來(lái)［1］。自1983年德國首先發(fā)現產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌以來(lái)，臨床發(fā)現產(chǎn)ESBLs的克雷伯菌越來(lái)越多，并且同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的克雷伯菌也時(shí)有報道，其耐藥機制比較復雜［2］。本文僅從克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的特性與藥敏結果的關(guān)系進(jìn)行研究，并進(jìn)一步對產(chǎn)AmpC酶的質(zhì)粒進(jìn)行基因型檢測，現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
(1)實(shí)驗菌株 536株肺炎克雷伯菌、15株產(chǎn)酸克雷伯菌、3株臭鼻克雷伯菌共554株克雷伯菌分離于2000年1月至2005年12月溫州醫學(xué)院附屬第一醫院和臺州市立醫院的住院患者，其中來(lái)自痰液289株，尿液111株，膿液、創(chuàng )面液、分泌物、膽汁、血液、腹水、穿刺液等標本共154株。經(jīng)Vitek60與Vitek32全自動(dòng)細菌分析儀鑒定。同一患者同類(lèi)標本多次分離到的菌株不重復計入。ESBLs檢測質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603由解放軍117醫院惠贈；AmpC酶檢測質(zhì)控菌株陰溝腸桿菌029M和陰溝腸桿菌1194E由中國施貴寶公司惠贈。作質(zhì)粒介導的供AmpC酶的基因檢測菌株有20株，為產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌。
(2)儀器與試劑 Vitek60與Vitek32全自動(dòng)細菌分析儀，GNS506、GNS120藥敏檢測卡均為法國B(niǎo)ioMerieux公司產(chǎn)品，藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品，MH瓊脂為浙江杭州天和微生物公司產(chǎn)品。PCR基因擴增試劑盒為無(wú)錫市克隆遺傳研究所產(chǎn)品，DNA Marker為Fermentas公司提供，瓊脂糖凝膠為美國Promega公司產(chǎn)品。
1.2 方法
(1)酶液提取 挑取血平板上過(guò)夜培養的數個(gè)菌落加入12ml胰胨肉湯，置于35℃恒溫搖床上(200r/min)孵育4～6h，4℃ 4000r/min離心25min。去沉淀物置-80℃反復凍融5次，1.5ml 0.01mol/L PBS(pH7.4)漩渦混勻，4℃ 9000r/min離心1h，去上清液即為酶提取液。
(2)ESBLs檢測 采用酶提取物三維試驗。根據ESBLs能水解第三代頭孢菌素，但不能被氯唑西林抑制的特點(diǎn)，參考文獻［3］操作，按標準紙片擴散法操作，取相當于1.5×108CFU/ml的標準大腸埃希菌ATCC25922菌液，接種MH瓊脂平板，平板中心貼一片30μg頭孢曲松(CRO)紙片，再距紙片中心5mm放射狀切四條狹縫，將40μl的酶提取液加入狹縫內，用36μl酶提取液加上4μl 2mol/L氯唑西林取代40μl的酶提取液加入另一狹縫，余狹縫加陰性和陽(yáng)性對照，35℃孵育過(guò)夜，若狹縫與抑菌環(huán)交界處出現生長(cháng)區域，視為三維試驗陽(yáng)性，即ESBLs陽(yáng)性。肺炎克雷伯菌ATCC700603為ESBLs陽(yáng)性對照，大腸埃希菌ATCC25922、陰溝腸桿菌029M為ESBLs陰性對照。
(3)AmpC酶檢測 按參考文獻［3］操作，將1.5×108CFU/ml的大腸埃希菌ATCC25922菌液密涂于MH瓊脂平板，稍干后在平板中心貼一片30μg的頭孢西丁紙片。用無(wú)菌刀片在離紙片5mm處放射狀的切一條狹縫，用微量加樣器加樣品25μl酶提取液加入狹縫內，避免酶液溢出狹縫，待酶液稍干后置于35℃孵育箱內過(guò)夜。若在狹縫與抑菌環(huán)的交界處出現擴大的長(cháng)菌區域，判為三維試驗陽(yáng)性，即AmpC酶陽(yáng)性。
(4)藥敏試驗 Vitek60型和Vitek32型全自動(dòng)細菌分析儀及KB瓊脂擴散法檢測細菌的藥敏結果，嚴格按照要求操作，并參考CLSI/NCCLS(2004年)標準判斷結果。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。
(5)基因檢測
質(zhì)粒AmpC酶基因檢測 每反應體系P1、P2引物各0.5μl，Taq DNA酶1U，dNTP、擴增緩沖液、Mg2+等按常規PCR配比加入，總反應體積20μl，其中模板5μl。擴增參數：93℃預變性2min，93℃變性30s，55℃褪火30s，72℃延伸60s，循環(huán)35個(gè)周期，最后一個(gè)循環(huán)72℃延長(cháng)至5min。PCR產(chǎn)物檢測經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(已加入溴化乙錠)，出現與陽(yáng)性對照分子相當的條帶，并與DNA Marker相比較分析，陽(yáng)性對照DHA為DHA1型陰溝腸桿菌。MIR為MIR型陰溝腸桿菌，純水為陰性對照。AmpC酶基因PCR擴增使用引物序列見(jiàn)表1。
PCR擴增 PCR引物序列見(jiàn)表2。與ESBLs有關(guān)的基因blaCTXM1群引物能擴增CTXM1、3、6、7、10、TOHO1群編碼基因，blaCTXM2群引物能擴增CTXM2、4、5群編碼基因，blaCTXM3群引物能擴增CTXM 8、9群編碼基因。擴增體系為每反應系P1、P2引物各0.5μmol，KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 2mmol/L，MgCl2 2mmol/L，TrisHCl (pH9.8) 10mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%，Taq DNA聚合酶1U�？偡磻w表1 AmpC酶基因PCR擴增引物表2 ESBLs、AMEs酶基因PCR引物序列積為20μl，其中模板液5μl。與氨基糖苷類(lèi)修飾酶(AMEs)有關(guān)的基因引物aac(3)II、aac(6′)I、ant(3")I與質(zhì)粒介導的AmpC有關(guān)的基因引物blaDHA、blaMIR引物的擴增參數：93℃預變性2min，93℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)72℃延長(cháng)至5min。與ESBLs有關(guān)的基因blaTEM、blaCTXM1群、blaCTXM2群、blaCTXM1群、blaSHV、blaPER引物擴增參數為：93℃預變性2min，93℃變性60s，55℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，延伸5min。PCR產(chǎn)物檢測經(jīng)1.5%～2%瓊脂糖凝膠電泳(已加入溴化乙錠)，出現于陽(yáng)性對照分子相當的條帶，并與DNA Marker相比較分析，純水為陰性對照。陽(yáng)性對照CTXM1群為CTXM3型大腸埃希菌，CTXM2群為CTXM5型大腸埃希菌，CTXM3群為CTXM9型大腸埃希菌，SHV為SHV2型大腸埃希菌，PER為PER1型銅綠假單胞菌，DHA為DHA1型陰溝腸桿菌。MIR為MIR陰溝腸桿菌，aac(6′)I為鮑曼不動(dòng)桿菌(AY536033)，aac(3)II為肺炎克雷伯菌(AY553610)，ant(3")I為鮑曼不動(dòng)桿菌(AY551438)［4］。
(6)藥敏結果統計學(xué)處理 用SPSS13.0作χ2檢驗。
2 結果
2.1 克雷伯菌分類(lèi)及產(chǎn)AmpC酶產(chǎn)ESBLs情況
554株克雷伯菌中肺炎克雷伯菌占96.75%，產(chǎn)酸克雷伯菌占2.71%，臭鼻克雷伯菌占0.54%；產(chǎn)AmpC酶66株，陽(yáng)性率為11.91%；產(chǎn)ESBLs 180株，陽(yáng)性率為32.49%，其中既產(chǎn)AmpC又產(chǎn)ESBLs的有42株，陽(yáng)性率為7.58%。
2.2 產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)或不產(chǎn)ESBLs菌株的藥敏
(1)產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs菌株的藥敏結果與產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs菌株的藥敏結果見(jiàn)表3。
(2)產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs的藥敏結果與不產(chǎn)AmpC酶但產(chǎn)ESBLs的藥敏結果見(jiàn)表4。
2.3 基因型
(1)肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs 20株檢測到產(chǎn)物長(cháng)度為405bp的blaDHA基因有7株，檢出率35%(7/20)，檢測到產(chǎn)物長(cháng)度為302bp的blaMIR基因有1株，檢測率5%(1/20)；未檢測到其它基因。它們的表型與AmpC基因型見(jiàn)表5。
(2)肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs 20株菌β內酰胺類(lèi)藥物的耐藥表型和基因型檢測結果見(jiàn)表6。
(3)肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs 20株菌的AMEs基因型分型見(jiàn)表7。
3 討論
(1)AmpC酶和ESBLs是介導革蘭陰性桿菌耐藥的最主要兩種酶，它們均能水解第三代頭孢菌素，但兩者又有重要區別，ESBLs可被β內酰胺酶抑制劑所抑制，不被氯唑西林抑制，且大部分產(chǎn)ESBLs菌對頭孢西丁敏感；AmpC酶則不被β內酰胺酶抑制劑所抑制，可被氯唑西林抑制，產(chǎn)酶株對頭孢西丁耐藥，因此準確檢測和區分這兩類(lèi)酶對臨床選擇用藥有重要意義［5］。 表3 克雷伯菌產(chǎn)AmpC同時(shí)產(chǎn)ESBLs與產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs的藥敏結果比較表4 肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs株與不產(chǎn)AmpC酶但產(chǎn)ESBLs株的藥敏結果比較近年來(lái)由于質(zhì)粒介導AmpC酶的出現［6］，導致耐藥性的廣泛傳播。質(zhì)粒介導的AmpC酶是1988年由美國發(fā)現，它與染色體介導的AmpC酶不同，可以高水平持續表達，可通過(guò)轉化、接合等方式轉移給其它細菌而造成耐藥性的廣泛傳播。除DHA1型外，大多數質(zhì)粒型AmpC酶是不可誘導的［4，7］。
(2)對于頭孢菌素來(lái)說(shuō)，由于產(chǎn)AmpC酶和不產(chǎn)ESBLs陰性的菌株均能水解第三代頭孢菌素(如表3所示)，其耐藥率都很高(65%～72%)，而產(chǎn)AmpC酶表6 肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs對β內酰胺類(lèi)藥物的耐藥表型和基因型檢測結果表7 肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs20株菌的AMEs基因型分型同時(shí)產(chǎn)ESBLs的菌株耐藥性更高(幾乎達100%)；對AmpC酶穩定的頭孢吡肟［8］在單純產(chǎn)AmpC酶的菌株中耐藥率達54.2%，在雙重產(chǎn)酶株中其耐藥率達85.7%。從表3可以看出，產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs菌株的藥敏結果，除第一代頭孢菌素(如頭孢唑林)無(wú)差異外，其它耐藥率明顯高于單純產(chǎn)AmpC酶的菌株，兩者有極顯著(zhù)性的差異。從表4可以看出，當單純產(chǎn)ESBLs時(shí)，頭孢吡肟有較好的活性，但當產(chǎn)AmpC同時(shí)產(chǎn)ESBLs時(shí)，頭孢吡肟幾乎失去活性。頭孢唑林也類(lèi)似，但頭孢曲松、頭孢他啶卻100%耐藥。
(3)從表3還可以看出，AmpC酶幾乎不能被含有克拉維酸的酶抑制劑所抑制，但含有三唑巴坦和舒巴坦的酶抑制劑對AmpC酶有一定的抑制作用，這與文獻［9，10］報道的結果一致；對氨基糖苷類(lèi)來(lái)說(shuō)，阿米卡星、慶大霉素對雙重產(chǎn)酶株與單純產(chǎn)AmpC酶菌株的藥敏結果無(wú)差異，而妥布霉素卻有顯著(zhù)差異。妥布霉素對雙重產(chǎn)酶株有一定的抑菌作用，但對單純產(chǎn)AmpC酶菌株效果不佳；對喹諾酮類(lèi)藥物左氧氟沙星、環(huán)丙沙星來(lái)說(shuō)，雙重產(chǎn)酶株的藥敏結果比單純產(chǎn)AmpC酶菌株效果還好，兩者有顯著(zhù)性差異，其中原因需進(jìn)一步研究。
(4)對于碳青霉烯類(lèi)亞胺培南，不管是否產(chǎn)AmpC酶還是產(chǎn)ESBLs酶，它的耐藥率總為0，所以說(shuō)碳青霉烯類(lèi)是治療產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的克雷伯菌的首選藥物，并且是最好的藥物；對頭霉素藥物頭孢替坦等，雖然它們的耐藥率也很低，但由于它們有很強的誘導DHA型質(zhì)粒AmpC酶的作用，臨床也很少選用。
(5)對產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌的ampC基因檢測的結果來(lái)看，blaDHA基因是肺炎克雷伯菌的產(chǎn)AmpC酶的主要基因。對20株產(chǎn)AmpC酶和同時(shí)產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測，75%菌株同時(shí)檢測到ESBLs基因型TEM、CTXM1及AmpC基因型DHA；20株菌中100%菌株檢測到基因型TEM，10%菌株檢測到ESBLs基因型SHV、DHA，90%檢測到CTXM1，15%檢測到MIR，提示在浙江的溫州和臺州地區存在基因型TEM、CTXM1 ESBLs和DHA基因型AmpC流行。
作者：王冬國 周鐵麗 《中國抗生素雜志》
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