沈陽(yáng)地區兒科產(chǎn)超廣譜β內酰胺酶革蘭陰性菌的耐藥性與基因型研究

【摘要】  目的 研究沈陽(yáng)地區兒科產(chǎn)超廣譜β內酰胺酶(extended�瞫pectrum β�瞝actamases，ESBLs)革蘭陰性菌的耐藥性及ESBLs基因型分布，初步探討其多重耐藥性傳播的分子機制。方法 KB法藥敏試驗，按照CLSI/NCCLS 2005年標準篩選確認ESBLs表型，PCR法進(jìn)行ESBLs基因型別分析，擴增I類(lèi)整合子全可變區，分析產(chǎn)ESBLs菌株中整合子的存在情況。結果 在分離出的180株革蘭陰性菌中，有62株經(jīng)表型確證試驗證實(shí)為產(chǎn)ESBLs菌株，檢出率34.4%。產(chǎn)ESBLs菌株對各種抗菌藥物的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株�；�因分型結果表明，blaTEM基因陽(yáng)性48株(77.4%)，blaSHV陽(yáng)性32株(51.6%)，blaCTX�睲9組陽(yáng)性31株(50%)，blaCTX�睲3組陽(yáng)性12株(19.4%)。62株ESBLs菌株中26株整合子全可變區PCR擴增陽(yáng)性，陽(yáng)性率41.9%。結論 沈陽(yáng)地區兒科革蘭陰性菌中ESBLs菌株檢出率較高，多數菌株同時(shí)攜帶兩種或兩種以上不同型別的β�矁弱０访�，且為多重耐藥菌株，整合子機制參與其多重耐藥性的形成與傳播。

【關(guān)鍵詞】  革蘭陰性菌；超廣譜β�矁弱０访�； 耐藥； 基因型； 整合子； 沈陽(yáng)地區； 兒科

　　Investigation of antimicrobial resistance and genotypes of extended�瞫pectrum　β�瞝actamases �瞤roducing Gram�瞡egative bacteria isolated　from pediatrics in Shenyang

　　ABSTRACT  Objective  To study the antimicrobial resistance and genotypes of extended�瞫pectrum β�瞝actamases (ESBLs)�瞤roducing Gram�瞡egative bacteria isolated from pediatrics in Shenyang and preliminarily investigate the molecular mechanisms of their multiple antibiotic resistance dissemination process.  Methods Antibiotics susceptibility was tested by Kirby�睟auer method. ESBLs�瞤roducing isolates were detected by phenotypic confirmatory test according to CLSI/NCCLS M100�睸15 (2005). The genotypes of ESBLs were analyzed by PCR, and the complete variable region of class 1 integron were amplified in order to analyze the presence and characterization of class 1 integron in ESBLs.  Results  Among a total of 180 Gram�瞡egative isolates, 62 isolates were identified as ESBLs by phenotypic confirmatory test and the incidence was 34.4%. The ESBLs�瞤roducing isolates were more resistant to most antimicrobials than non�� ESBLs�瞤roducers. The results of β�瞝actamases genotyping showed that 48 isolates carried blaTEM (77.4%)，32 isolates carried blaSHV (51.6%), 31 isolates carried blaCTX�睲��9 (50%)and 12 isolates carried blaCTX�睲��3 (19.4%). Class 1 integrons were identified among 26 isolates and the positive rate was 41.9%.  Conclusions  In Shenyang pediatrics, the incidence of ESBLs�瞤roducing strains was high and most isolates were multiple resistant and produced more than one type of β�瞝actamase. The mechanisms of integron took part in the emergence and dissemination of their multiple resistance.

   

　　KEY WORDS  Gram�瞡egative bacteria;  Extended�瞫pectrum β�瞝actamases;  Resistance;  Genotype;  Integron;  Shenyang area;  Pediatrics 

　　產(chǎn)超廣譜β內酰胺酶(ESBLs)是革蘭陰性菌對第三代頭孢菌素及單環(huán)內酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥的重要原因［1，2］。兒科患者由于年齡和疾病等因素，是產(chǎn)超廣譜β�矁弱０访讣毦�的易感人群。為了解沈陽(yáng)地區兒科產(chǎn)超廣譜β�矁弱０访父锾m陰性菌的耐藥情況和基因型特征，為沈陽(yáng)地區兒科抗生素使用及臨床預防產(chǎn)ESBLs細菌引起的感染提供參考依據，本文對2005年1月～2005年12月沈陽(yáng)市兒科患者中分離的180株革蘭陰性桿菌進(jìn)行ESBLs表型篩選和確認，分別用TEM、SHV、CTX�睲、OXA、PER和VEB型β�矁弱０访富�因的特定引物進(jìn)行PCR擴增，分析ESBLs基因型別，擴增I類(lèi)整合子全可變區，探討其多重耐藥性的傳播機制。

　　1  材料與方法

　　1.1  菌株來(lái)源

   

　　2005年1月～2005年12月沈陽(yáng)市兒科患者中臨床分離的革蘭陰性桿菌180株，其中包括大腸埃希菌59株，克雷伯菌屬27株，銅綠假單胞菌29株，不動(dòng)桿菌屬22株，陰溝腸桿菌11株，聚團腸桿菌5株，產(chǎn)氣腸桿菌2株，弗氏檸檬酸桿菌5株，黏質(zhì)沙雷菌7株，液化沙雷菌3株，嗜麥芽寡養單胞菌6株，熒光假單胞菌2株，奇異變形菌1株，摩根摩氏菌1株。所有菌株均采用法國B(niǎo)io�睲erieux公司全自動(dòng)微生物鑒定系統的革蘭陰性菌鑒定卡確認。

　　1.2  抗生素紙片

   

　　氨芐西林(ABPC)、哌拉西林(PIPC)、阿米卡星(AMK)、頭孢呋辛(CXM)、頭孢唑林(CEZ)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢曲松(CRO)、頭孢克洛(CCL)、頭孢吡肟(CPE)、頭孢西丁(CFX)、哌拉西林/三唑巴坦(PIPC/TB)、環(huán)丙沙星(CPLX)、左氧氟沙星(LFLX)、復方磺胺甲口惡唑(SMZ/TMP)、慶大霉素(GM)、氨曲南(AZ)、亞胺培南(IMP)，頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CA)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/CA)和阿莫西林/克拉維酸(AMPC/CA)，以上紙片均為英國Oxoid公司產(chǎn)品。

　　1.3  主要試劑與儀器

   

　　MH(Mueller�睭inton)瓊脂、肉湯培養基為英國Oxoid公司產(chǎn)品；DNA分子量標準(DL2000)、dNTP、Taq DNA聚合酶均購自TaKaRa公司；PCR擴增儀(美國PE公司GeneAmp PCR System 2700型)；DY�瞁I恒壓恒流電泳儀(北京六一廠(chǎng))；凝膠成像系統(美國Kodak公司)。

　　1.4  藥敏試驗及產(chǎn)ESBLs菌株的篩選與確認

   

　　采用KB紙片擴散法，進(jìn)行所有菌株的藥敏試驗。同時(shí)按照美國國家臨床實(shí)驗室標準化研究所(CLSI/NCCLS)2005年版推薦的標準進(jìn)行ESBLs初步篩選和表型確證試驗［3］。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922(陰性對照株)，大腸埃希菌ATCC35218(產(chǎn)廣譜β�矁弱０访钢�)，肺炎克雷伯菌ATCC700603(產(chǎn)超廣譜β�矁弱０访钢�)。

　　1.5  ESBLs基因的PCR擴增

   

　　采用煮沸法提取細菌DNA，取處于對數生長(cháng)期的新鮮菌液1ml，離心收集菌體，加入600μl雙蒸水，煮沸15min，快速冷卻，15000r/min離心10min，上清液即可作為DNA模板進(jìn)行PCR擴增。根據GenBank和EMBL公布的各型ESBLs耐藥基因序列設計引物，由大連寶生物公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

　　1.6  產(chǎn)ESBLs菌株耐藥性傳播機制

   

　　根據I類(lèi)整合子的5′保守區和3′保守區設計引物，擴增其全可變區，分析ESBLs菌株中I類(lèi)整合子的存在情況。引物序列見(jiàn)表1，循環(huán)參數為94℃預變性5min，94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 3min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀(guān)察結果。

　　2  結果

　　2.1  ESBLs菌株檢測結果

   

　　在分離出的180株革蘭陰性菌中，62株經(jīng)表型確證試驗證實(shí)為產(chǎn)ESBLs菌株，檢出率為34.4%，其中大腸埃希菌30株，克雷伯菌屬15株，陰溝腸桿菌6株，沙雷菌8株，聚團腸桿菌2株，弗氏檸檬酸桿菌1株。

　　2.2  ESBLs菌株與非ESBLs菌株耐藥性比較

   

　　產(chǎn)ESBLs菌株多表現為多重耐藥，對各種抗菌藥物的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株。其中ESBLs菌株對氨芐西林、哌拉西林、頭孢呋辛、頭孢唑林、頭孢克洛、頭孢噻肟和頭孢曲松等7種抗生素的耐藥率達到了100%；亞胺培南、阿米卡星、頭孢吡肟、頭孢他啶、哌拉西林/三唑巴坦對ESBLs菌株仍保持較高抗菌活性，比較結果見(jiàn)表2。

2.3  β�矁弱０访富�因型

   

　　本研究采用8對β�矁弱０访富�因引物進(jìn)行擴增，其中blaCTX�睲2組、blaPER、blaVEB及blaOXA��23基因未擴增出陽(yáng)性結果，blaTEM、blaSHV、blaCTX�睲3組和blaCTX�睲9組擴增產(chǎn)物片段大小與預期相符(圖1)。62株產(chǎn)ESBLs菌株中blaTEM基因陽(yáng)性48株(77.4%)，blaSHV陽(yáng)性32株(51.6%)，blaCTX�睲9組陽(yáng)性31株(50%)，blaCTX�睲3組陽(yáng)性12株(19.4%)。各型β�矁弱０访富�因單獨或聯(lián)合檢出情況見(jiàn)表3。       

　　表1  β�矁弱０访富�因及I類(lèi)整合子PCR擴增所用引物　略

　　表2        產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs革蘭陰性菌的耐藥率(略)

　　表3        ESBLs菌株β�矁弱０访富�因型分布　略

　　2.4  ESBLs菌株整合子檢測

   

　　62株ESBLs菌株中26株整合子全可變區PCR擴增陽(yáng)性，陽(yáng)性率41.9%，其中大腸埃希菌10株，克雷伯菌屬9株，陰溝腸桿菌3株，聚團腸桿菌2株，沙雷菌2株。陽(yáng)性菌株擴增片段多介于1000～2000bp之間(常見(jiàn)1.8kb左右的擴增產(chǎn)物)，另有1株擴增產(chǎn)物大于2000bp，1株擴增出兩條不同大小片段的陽(yáng)性帶。部分菌株整合子擴增情況見(jiàn)圖2。

　　3  討論

   

　　近年來(lái)由于超廣譜β�矁弱０奉�(lèi)抗生素在臨床上大量使用，導致產(chǎn)ESBLs的革蘭陰性菌不斷增加［1］。我國已有部分地區報道大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBLs檢出率超過(guò)50%［9，10］。第三代頭孢菌素因抗菌譜廣、毒性較低等特點(diǎn)，常常在兒科住院患者中大量甚至長(cháng)期使用，因此兒童ESBLs發(fā)生率并不亞于成人。張泓等報道兒童呼吸道感染病原菌ESBLs檢出率在大腸埃希菌為32.6%，肺炎克雷伯菌為28.6%［11］。本研究對沈陽(yáng)地區180株從兒科患者分離的革蘭陰性菌進(jìn)行ESBLs的篩選及確證，檢出率為34.4%；本組62株ESBLs全部為多重耐藥株，對青霉素、第一、二代頭孢菌素及部分第三代頭孢菌素的耐藥率達到100%，應引起臨床醫生高度重視。   

　　ESBLs的編碼基因分布具有明顯的地域特點(diǎn)［2］，如blaTEM和blaSHV型是北美地區流行的主要基因型［12］，韓國以blaSHV��12更常見(jiàn)［13］。近年來(lái)，非TEM、非SHV型ESBLs種類(lèi)和數量都不斷增加，包括CTX�睲、PER、VEB和OXA等類(lèi)型。其中CTX�睲型酶對頭孢噻肟具有強大的水解活性，對頭孢曲松的水解能力也很高，但對頭孢他啶和氨曲南的水解能力較差。自20世紀90年代初在歐洲發(fā)現以來(lái)［14］，已遍及東南亞、歐洲等地區［15～17］。我國北京、上海、浙江、廣州等地報道的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs基因型也均以CTX�睲型為主，其次為SHV型［18，19］。本研究發(fā)現，沈陽(yáng)地區兒科CTX�睲型ESBL累計檢出率達69.4%，與其耐藥表型相符；本組62株ESBLs頭孢噻肟和頭孢曲松耐藥率達100%，而頭孢他啶耐藥率僅為40.3%。本組blaTEM和blaSHV基因檢出率也較高，分別為77.4%和51.6%，但是否為T(mén)EM和SHV型ESBL還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

   

　　整合子介導的多重耐藥及水平傳播機制近年已越來(lái)越引起人們的重視。整合子是具有捕獲外源基因并使之轉變?yōu)楣δ苄曰�因的表達單位，它可將β�矁弱０奉�(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)等多種耐藥基因以基因盒的方式組裝在一起，并可在菌種內及種間傳播，容易引起院內感染的暴發(fā)流行［20，21］。本研究結果顯示，ESBLs菌株整合子的發(fā)生率較高，62株中41.9%攜帶I類(lèi)整合子，整合子片段大小介于1.0～3.0kb之間，并有攜帶多個(gè)I類(lèi)整合子的傾向，它們含有不同的耐藥基因，參與形成ESBLs細菌多重耐藥表型，并引起菌種內及菌種間多重耐藥性的水平傳播。

   

沈陽(yáng)地區兒童也面臨著(zhù)產(chǎn)ESBLs多重耐藥的革蘭陰性菌感染的威脅，這與臨床上長(cháng)期以來(lái)大量使用頭孢噻肟等第三代頭孢菌素有關(guān)。臨床抗菌藥物大量和不合理應用促進(jìn)了產(chǎn)酶株的出現，也是整合子發(fā)生進(jìn)化和捕獲更多耐藥基因的重要原因。因此兒科臨床亦應嚴格限制和合理使用抗生素，進(jìn)行細菌耐藥性的監測，采取積極有效的消毒隔離和治療措施，以減少產(chǎn)酶菌株的出現，控制ESBLs及其耐藥基因的水平傳播。

作者：倪朝輝 李凡《中國抗生素雜志》

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