1株攜帶多種抗生素滅活酶基因的銅綠假單胞菌臨床分離株

【摘要】  目的 了解銅綠假單胞菌攜帶多種抗生素滅活酶基因的情況和有關(guān)機制。方法應用聚合酶鏈式反應(PCR)法對多重耐藥的銅綠假單胞菌進(jìn)行β�矁弱０访富�因、氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因和oprD2基因檢測與分析。結果 PCR結果顯示CARB和TEM型β�矁弱０访富�因，aac(6′)�睮、aac(6′)�睮I、ant(2″)�睮、ant(3″)�睮氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因擴增陽(yáng)性。oprD2基因擴增檢測呈缺失型。CARB和TEM型β�矁弱０访富�因擴增產(chǎn)物經(jīng)測序、BLASTn比對分析為blaCARB��3和blaTEM��1。結論 銅綠假單胞菌可攜帶多種抗生素滅活酶基因，多重耐藥銅綠假單胞菌(MDRP)的逐漸增多，嚴重威脅臨床的抗感染治療。

【關(guān)鍵詞】  銅綠假單胞菌；抗生素滅活酶； 多重耐藥

　　銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)為條件致病菌。近年來(lái)銅綠假單胞菌多重耐藥株引起的感染常使臨床治療面臨諸多困難。近年研究發(fā)現，銅綠假單胞菌可以通過(guò)獲得抗生素滅活酶而耐藥。如：獲得各種β�矁弱０访妇幋a基因和/或外膜孔蛋白oprD2基因缺失導致對β�矁弱０奉�(lèi)抗生素耐藥［1～5］，獲得氨基糖苷類(lèi)修飾酶鈍化氨基糖苷類(lèi)抗生素而耐藥［6］。我們從一例肺癌合并嚴重肺部感染患者的氣管分泌物中分離出一株多重耐藥銅綠假單胞菌，對其進(jìn)行β�矁弱０访富�因、氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因和oprD2基因檢測與分析，現報道如下。

　　1  材料與方法

　　1.1  標本來(lái)源

   

　　患者沈某，女性，81歲。2005年7月因肺癌合并嚴重肺部感染入院，從患者氣管分泌物中分離到銅綠假單胞菌WX2232。

　　1.2  菌株鑒定

   

　　細菌鑒定采用法國VITEK��32全自動(dòng)微生物鑒定系統。

　　1.3  藥敏試驗

   

　　抗生素敏感試驗采用微量肉湯稀釋法， 按CLSI/NCCLS(1999年)標準操作及判斷結果，抗生素包括氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢唑林、亞胺培南、氨曲南、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復方磺胺甲口惡唑、呋南妥因、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦。

　　1.4  耐藥基因檢測

   

　　(1)模板制備  挑純培養菌落置入0.5ml離心管內(管內預置200ng/ml蛋白酶K溶液)。56℃水浴2h，改95℃水浴10min。15000r/min離心30s，上清液移入另一新的0.5ml離心管作為模板液置-20℃冰箱備用。

   

　　(2)耐藥基因的檢測  β�矁弱０访富�因、氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因和oprD2基因檢測均為聚合酶鏈反應(PCR)法。PCR擴增引物序列見(jiàn)表1。各種靶基因PCR擴增體系均為：每反應體系P1、P2引物各0.5μmol/L，KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，Tris�睭Cl(pH9.0)10mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%(W/V)，Taq DNA聚合酶1U�？偡磻�體積20μl(其中模板液5μl)。產(chǎn)物>500bp熱循環(huán)參數均為：93℃預變性2min，然后93℃60s→55℃ 60s→72℃ 60s， 循環(huán)35個(gè)周期，最后一次72℃延長(cháng)至5min。產(chǎn)物<500bp熱循環(huán)參數均為：93℃預變性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循環(huán)35周期，最后一次72℃延長(cháng)至5min。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，出現與陽(yáng)性對照分子相當的目的條帶判為陽(yáng)性，并攝像保存。測序為雙脫氧末端終止法在3730儀(美國ABI公司)上進(jìn)行。測得序列與美國GenBank核酸庫已登錄的序列作比對(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。耐藥基因檢測試劑盒、靶基因PCR引物序列和陽(yáng)性對照DNA由無(wú)錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。

2  結果

   

　　銅綠假單胞菌WX2232株除對哌拉西林/三唑巴坦敏感(64μg/ml)外，對β�矁弱０奉�(lèi)(氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢唑林、亞胺培南、氨曲南、氨芐西林/舒巴坦)、氨基糖苷類(lèi)(慶大霉素、妥布霉素)、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復方磺胺甲口惡唑、呋南妥因等均耐藥。PCR結果顯示CARB、TEM型β�矁弱０访富�因，aac(6′)�睮、aac(6′)�睮I、ant(2″)�睮、ant(3″)�睮氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因擴增陽(yáng)性。oprD2基因擴增檢測呈缺失型。CARB、TEM型β�矁弱０访富�因擴增產(chǎn)物經(jīng)測序、BLASTn比對分析為blaCARB��3和blaTEM��1。圖1、2為aac(6′)�睮基因PCR電泳圖。

　　3  討論

   

　　銅綠假單胞菌WX2232株對β�矁弱０奉�(lèi)(氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢唑林、亞胺培南、氨曲南、氨芐西林/舒巴坦)、氨基糖苷類(lèi)(慶大霉素、妥布霉素)抗生素均耐藥。PCR檢測顯示blaCARB(blaCARB��3型)、blaTEM(blaTEM��1型)、aac(6′)�睮、aac(6′)�睮I、ant(2″)�睮、ant(3″)�睮基因陽(yáng)性和oprD2基因呈缺失型，表型與基因型相符。oprD2基因所編碼的銅綠假

       

　　表1        PCR引物序列　略

　　圖1    略

　　圖2    略

oprD2基因缺失是銅綠假單胞菌WX2232株亞胺培南、β�矁弱０奉�(lèi)/β�矁弱０访敢种苿�復合制劑耐藥的原因。隨著(zhù)廣譜頭孢菌素類(lèi)、碳青霉素烯類(lèi)抗生素在臨床上大量使用，銅綠假單胞菌對臨床常用抗生素靈敏度不斷的下降，尤其是多重耐藥銅綠假單胞菌(MDRP)的逐漸增多嚴重威脅臨床的抗感染治療［8］，如何合理應用抗生素，以及采取有效措施控制耐藥株出現，是需要著(zhù)力解決的問(wèn)題。

 

作者：王繼東  糜祖煌  周麗珍《中國抗生素雜志》

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