近年來(lái)，隨著(zhù)β-內酰胺類(lèi)抗生素，尤其是頭孢三代類(lèi)藥物的廣泛應用，引起產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）、AmpCβ-內酰胺酶（AmpC酶）、ESBLs+AmpC酶等一系列耐藥菌株的產(chǎn)生，細菌耐藥現象日益嚴重。為更好地了解我院臨床分離菌株中產(chǎn)ES-BLs、ESBLs+AmpC酶肺炎克雷伯菌的檢出率及耐藥性，對138株肺炎克雷伯菌進(jìn)行ESBLs、ESBLs+Am-pC酶測定及藥敏試驗，現將結果報道如下。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1試驗菌株 138株肺炎克雷伯菌均為我院2003年8月～2004年8月住院及門(mén)診病人感染標本中分離的菌株，根據臨床資料去除重復菌株。
1.1.2質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603，分別作為產(chǎn)ESBLs陰性和陽(yáng)性對照菌。
1.1.3 VITEK-AMS細菌鑒定系統及配套的GNI鑒定卡與GNS-120藥敏卡為生物梅里埃公司生產(chǎn)。
1.1.4 藥敏紙片 頭孢替坦（CTT）、頭孢吡肟（FEP）為英國Oxoid產(chǎn)品，亞胺培南（IPM）由默沙東公司提供，頭孢哌酮/舒巴坦（SCF）為舒普深公司提供，哌啦西林/他唑巴坦（TZP）等紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。
1.1.5藥敏用培養基 Mueller-Hinton瓊脂，英國Oxoid產(chǎn)品。
1.2方法
1.2.1菌株培養和鑒定細菌分離培養按照《全國臨床檢驗操作規程》進(jìn)行。用VITEK-AMS專(zhuān)用卡GNI+鑒定。
1.2.2ESBLs檢測
（1）VITEK-AMS測定:采用GNS-120專(zhuān)用藥敏卡，嚴格按說(shuō)明書(shū)操作，儀器自動(dòng)檢查其ESBLs4個(gè)檢測孔，頭孢他啶（CAZ）與頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/CA），頭孢噻肟（CTX）與頭孢噻肟/克拉維酸（CAZ/CA）孔的生長(cháng)濁度≥50%時(shí)，判定為ESBLs陽(yáng)性。
（2）雙紙片協(xié)同試驗及確認試驗:將阿莫西林/克拉維酸（AMC）紙片置Mueller-Hinton平板中央，依次貼上頭孢曲松（CRO）、CAZ、CAZ/CA、ATM、CTX、CTX/CA，其中CRO、CAZ、氨曲南（ATM）、CTX與AMC距離為18mm，CAZ/CA、CTX/CA與AMC距離為25mm，且CAZ/CA、CTX/CA與其它紙片間距離>24mm。
（3）雙紙片協(xié)同試驗結果判斷:如在A(yíng)MC紙片與其周?chē)鶦RO、CAZ、ATM、CTX任一種紙片處出現協(xié)同抑菌視為產(chǎn)超廣譜β-內酰胺初篩陽(yáng)性。
（4）確認試驗:按NCCLs紙片標準，CAZ、CAZ/CA和CTX、CTX/CA2組抗生素紙片任一組中含CA的紙片和不含CA的紙片菌抑菌圈直徑相差≥5mm，即為產(chǎn)ESBLs菌株。
1.2.3產(chǎn)ESBLs+AmpC酶株的檢測
（1）表型篩選試驗參閱文獻 ［1，2］選用IPM、FEP、CAZ/CA、CAZ、CTX/CA、CTX、CTT7種抗生素進(jìn)行篩選試驗。若IPM敏感，而CTT、FEP、CAZ、CAZ/CA、CTX、CTX/CA耐藥為產(chǎn)ESBLs+AmpC酶株。
（2）擴散協(xié)同試驗參閱文獻 ［3，4］經(jīng)表型篩選試驗為產(chǎn)ESBLs+AmpC酶株作擴散協(xié)同試驗，每株菌取兩平板，一平板將AMC紙片置Mueller-Hinton平板中央，四周依次貼上CAZ、CTX、ATM、CRO;另一平板將AMC紙片置Mueller-Hinton平板中央，在與AMC紙片距離為15mm、20mm、25mm、30mm處各貼FEP。若AMC與CAZ、CTX、ATM、CRO不協(xié)同，但與
FEP協(xié)同為產(chǎn)ESBLs+AmpC酶株。
1.2.4藥敏試驗采用紙片擴散（K-B法），判斷標準按NCCLs2002版標準執行。
1.2.5統計分處理采用WHONET5軟件。
2結果
2.1產(chǎn)ESBLs陽(yáng)性率及病房分布臨床分離株138株，經(jīng)VITEK GNS-120卡鑒定56株產(chǎn)ESBLs，紙片協(xié)同法55株產(chǎn)ESBLs，紙片確認法57株產(chǎn)ESBLs占41.3%（57/138）。各科室產(chǎn)ESBLs株從高到低依次為:神經(jīng)外科30株，其中28株為NCU病房，2株為普通病房的同一床位，且時(shí)間較近。ICU病房8株，嬰兒科5株，其余8株來(lái)自外科病房，6株來(lái)自?xún)瓤撇》俊?/DIV>
2.2 產(chǎn)ESBLs+AmpC酶陽(yáng)性率
57株產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌中，2株表型CTT、FEP、CAZ、CAZ/CA、CTX、CTX/CA均耐藥，IPM敏感，確定為ESBLs+AmpC酶株，占1.4%（2/138），另外55株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌，有23株CTT紙片抑菌環(huán)內存在散在菌落，挑取其散的菌落，經(jīng)VITEK鑒定為肺炎克雷伯菌，對其進(jìn)行表型篩選試驗，CTT、FEP、CAZ、CAZ/CA、CTX、CTX/CA耐藥，IPM敏感。說(shuō)明其散在菌落為同時(shí)產(chǎn)ESBLs+AmpC酶株，占16.7%（23/138），25株占18.1%（25/138）。對25株表型為產(chǎn)ESBLs+AmpC酶株進(jìn)行擴散協(xié)同試驗:FEP與AMC距離為15mm時(shí)，23株發(fā)生協(xié)同反應;距離為20mm時(shí)，17株發(fā)生協(xié)同反應;距離為25mm時(shí)，10株發(fā)生協(xié)同反應;距離為30mm時(shí)，2株發(fā)生協(xié)同反應。
2.3耐藥率
2.3.1非ESBLs、ESBLs+AmpC酶株、產(chǎn)ESBLs、產(chǎn)ESBLs+AmpC酶的肺炎克雷伯菌的耐藥性，見(jiàn)表1。 表1非產(chǎn)ESBLs、ESBLs+Ampc酶株，產(chǎn)ESBLs株，產(chǎn)ESBLs+Ampc酶株對16種抗菌藥物的藥敏結果（略）注:與Ⅰ組比較， * P<0.05;與Ⅱ組比較， △ P<0.05
2.3.223株CTT紙片抑菌環(huán)內散在菌落（產(chǎn)ES-BLs+AmpC酶株）與原分離株（產(chǎn)ESBLs）藥敏對照:對IPM均敏感，產(chǎn)ESBLs株對環(huán)丙沙星（CIP），慶大霉素（GM）、阿米卡星（AK）、復方磺胺甲口惡唑（SXT）敏感的，對應的產(chǎn)ESBLs、ESBLs+Ampc酶株表現為耐藥。
3討論
超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）是一類(lèi)新的β-內酰胺酶（BLA），屬Bush分類(lèi)中的2be類(lèi)酶，主要產(chǎn)生于大腸埃希菌和克雷伯菌屬，能水解三代頭孢如頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟和單環(huán)酰胺類(lèi)氨曲南，并被BLA抑制劑如克拉維酸抑制 ［5，6］。AmpC酶是染色體或質(zhì)粒介導的頭孢菌素酶，能水解三代頭孢及 單環(huán)酰胺類(lèi)，不能被BLA抑制劑和頭霉素類(lèi)抑制，能被四代頭孢、碳青霉烯類(lèi)抑制。產(chǎn)ESBLs+AmpC酶株對三代頭孢、單環(huán)酰胺類(lèi)、頭霉素類(lèi)及含酶抑制劑、四代頭孢均高度耐藥，可用碳青霉烯類(lèi)及在藥敏試驗敏感的氨基糖苷類(lèi)或氟喹諾酮類(lèi)。本研究發(fā)現57株產(chǎn)ESBLs菌中有23株CTT抑菌環(huán)內存在散在菌落，而用VITEK-120藥敏卡儀器鑒定為CTT敏感。對這類(lèi)菌株如果用頭霉素類(lèi)或酶抑制劑，則可能篩選出高產(chǎn)的ESBLs+AmpC酶株而導致臨床治療無(wú)效，建議臨床微生物室對經(jīng)VITEK GNS-120藥敏卡鑒定為產(chǎn)ESBLs株補貼頭霉素類(lèi)藥敏，可及時(shí)發(fā)現抑菌環(huán)內的耐藥株（產(chǎn)EBSLs+AmpC酶株），并及時(shí)將信息報告給臨床醫生，以有效控制ESBLs+Am-pC酶株的傳播流行。
對于產(chǎn)EBSLs+AmpC酶株檢測，表現篩選實(shí)驗符合率為89.58% ［1］ 擴散協(xié)同法FEP與AMC距離國內未見(jiàn)報道，本研究參照檢測ESBLs擴散協(xié)同法 ［7］ ，FEP與AMC距離設定為1mm、20mm、25mm、30mm，產(chǎn)生協(xié)同反應分別為23株、17株、10株與2株，故推薦距離15mm時(shí)為最佳距離。
作者：卜黎紅 徐瑞龍 單小云 許健波 朱以軍《全科醫學(xué)臨床與教育》
參考文獻
1周志慧，李蘭娟，俞云松等.兩種檢測陰溝腸桿菌AmpC酶方法的比較［J］.中華檢驗醫學(xué)雜志，2002，259（2）:88-90.
2趙虎，孫憲濤.AmpCβ內酰胺的檢測［J］.中華檢驗醫學(xué)雜志，2003，26（6）:390-392.
3張樂(lè )海，傅云霜，馬麗霞，等.雙抑制劑擴散協(xié)同法檢測兩種超廣譜β-內酰胺酶［J］.中華檢驗醫學(xué)雜志，2001，24（4）: 211-213.
4Tzouvelekis LS，Vatopoulos AC，katsanis G，et al.Rare case of failure by an automated system to detect extended-spectrum beta-lactamases in a cephalosporin-resistant klebsiella pneumoniae isolate［J］.J Clin Microbiol，1999，37（7）:2388.
5Jacoby GA.Extend-spectrumβ-lactamases and other en zymes providing resistance to oxyimino-β-lactams［J］.Infect Dis Clin North Am，1997，11（4）:875-887.
6俞云松，陳亞崗，周偉珠，等.一種新基因型SHV-28-β-內酰胺酶的發(fā)現及其特性的初步研究［J］.中華檢驗醫學(xué)雜志，2001，24（4）:204-206.
7趙旺勝，許乃順，葛高霞，等.南京地區產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶株的調查及藥敏分析［J］.臨床檢驗雜志，2000，18（4）:233-234.
上一篇：大腸埃希菌O157:H7檢測方法探討
下一篇：ESBLs陽(yáng)性的大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌藥敏實(shí)驗結果比較
海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
