大腸埃希菌O157:H7檢測方法探討

【摘要】  目的  對大腸埃希菌O157:H7的檢測方法進(jìn)行探討，減輕日常工作量，節約成本，提高陽(yáng)性檢出率。方法  將PCR技術(shù)和免疫磁珠法相結合，樣品先進(jìn)行PCR檢測，陽(yáng)性的樣品再以免疫磁珠法進(jìn)行分離和鑒定。結果  從245件豬糞、牛糞樣品中應用免疫磁珠和PCR結合方法，陽(yáng)性檢出率為8.98%，高于直接應用免疫磁珠法的陽(yáng)性檢出率6.12%。結論  此方法為大腸埃希菌O157:H7的檢測提供了一個(gè)新的思路，節約了人力和物力，提高了工作效率和陽(yáng)性檢出率。

   

    【關(guān)鍵詞】  免疫磁珠法；大腸埃希菌O157:H7；PCR技術(shù)

   

    Study on method for detecting E.coli O157:H7

    

    【Abstract】  Objective  To discuss the detection  method for E.coli O157:H7.We can economize cost，release the work，enhance the positive rate.Methods  Combined the polymerase chain reaction technique with immunomagnetic sand method，we could detect these samples with PCR at first，and then collected and detected the positive species by using immunomagnetic sand method.Results  We have detected 245 species of dung by using this operational procedure.The result proved that the positive rate can be up to 8.98% above the rate of 6.12% by using immunomagnetic sand method only.Conclusion  It is a new idea for us to release the work and enhance the positive rate by using this operational procedure for detect the E.coli O157:H7.

   

    【Key words】  immunomagnetic sand method;  E.coli O157:H7; polymerase chain reaction 

    

    自從1982年在美國發(fā)生了首次由大腸埃希菌O157:H7引起出血性腸炎暴發(fā)以來(lái)，該菌在世界范圍內曾有過(guò)多次食源性暴發(fā)。1996年在日本發(fā)生的人類(lèi)歷史上規模最大的一次暴發(fā)，引起了全世界的關(guān)注［1］。目前大腸埃希菌O157:H7 感染呈全球流行，已被認定是20世紀70年代以來(lái)新發(fā)現的8種傳染病病原體之一［2］。我國亦加強了大腸埃希菌O157:H7的監測。為了提高陽(yáng)性檢出率，減輕工作量，本課題對大腸埃希菌O157:H7的檢測方法進(jìn)行了探討和研究。

   

    1  材料與方法

   

    1.1  樣品來(lái)源  2004年5～10月采集奉賢區各個(gè)畜牧場(chǎng)豬糞、牛糞樣品，共計245件。

   

    1.2  儀器與試劑

   

    1.2.1  PCR擴增儀  Techne Flexigene。

   

    1.2.2  大腸埃希菌O157PCR引物  上游引物：5’ AGGGCTATTGGTTCGTTCCT 3’，下游引物：5’ AGGCCTGAAAGTCGTAGCAA 3’，其擴增產(chǎn)物片段長(cháng)度為519bp。上述引物及相關(guān)試劑由上海寶生科技發(fā)展有限公司合成提供。

   

    1.2.3  全自動(dòng)數碼凝膠成像系統  Tanon GIS-2010。

   

    1.2.4  免疫磁珠試劑、混勻器  (Dynabeads anti-E.coli O157;Dynal Sample Mixer)。

   

    1.2.5  培養基及診斷血清  MEC增菌液及各類(lèi)糖發(fā)酵生化試劑均由上海市疾病預防控制中心提供。Chromagar O157顯色平板由上海博塞科技發(fā)展有限公司提供。大腸埃希菌O157及H7診斷血清由成都生物制品研究所提供，均在有效期內使用。

   

    1.3  方法

   

    1.3.1  PCR檢測法

   

    1.3.1.1  樣品的前處理  將樣品棉簽置于MEC增菌液9ml中，42℃增菌18h后，以5合1的混合方式，將增菌液混合。2500rpm離心10min。取上清液500μl，12000rpm離心5min，棄上清液，加100μl DNA提取液入沉淀中，振蕩混勻，置100℃水浴加熱10～15min，10000rpm離心1min，保留上清液待用。

   

    1.3.1.2  PCR擴增反應  取4μl上清液加入26μl PCR反應液中，同時(shí)做陽(yáng)性對照。振蕩混勻，于2000rpm離心5s，將PCR反應管放入PCR擴增儀中。首先預變性94℃5min，然后按94℃ 30～40s、55℃ 30～40s、72℃ 30～40s循環(huán)35次，最后72℃延長(cháng)3min。

   

    1.3.1.3  電泳及結果判斷  取15μl的擴增產(chǎn)物加入2%瓊脂糖凝膠孔中，接通電源，根據指示劑遷移的位置，判斷是否終止電泳。用凝膠成像系統對電泳結果進(jìn)行分析。比較陽(yáng)性對照，大腸埃希菌O157: H7特異性產(chǎn)物519bp為陽(yáng)性。然后將PCR陽(yáng)性的混合樣品再進(jìn)行單個(gè)PCR檢測，確定單個(gè)陽(yáng)性樣品。

   

    1.3.2  免疫磁珠富集法  吸取樣品增菌液1ml和20μl抗大腸埃希菌O157磁珠試劑于離心管中，置Dynal磁架上，放在混合器上輕輕攪動(dòng)10min后，將磁板插入磁架，顛倒混勻3min，使濃縮磁珠吸附在管壁中間。打開(kāi)離心管，小心吸取懸浮液，將磁板取下，加入1ml洗滌緩沖液(PBS-吐溫)，蓋上蓋，將磁架顛倒數次，置于混勻器重新懸浮磁珠。重復洗滌，懸浮過(guò)程3次后，用100μl洗滌液沖洗懸浮濃縮的磁珠細菌混合物，做成混懸液。將混懸液接種于Chromagar O157顯色平板，37℃培養24h。挑取可疑菌落于克氏雙糖培養基，37℃培養24h后，血清凝集，并做生化反應。

   

    1.3.3  PCR技術(shù)與免疫磁珠法結合檢測方法  將經(jīng)PCR檢測為陽(yáng)性的樣品再進(jìn)行免疫富集分離鑒定。

   

    2  結果

   

    2.1  大腸埃希菌O157:H7檢出情況  不同大腸埃希菌O157:H7分離方法取得的陽(yáng)性率有所不同。PCR方法陽(yáng)性檢出率最高，達 10.2%。免疫磁珠法檢出15株，陽(yáng)性檢出率為6.12%，兩者結合方法的陽(yáng)性檢出率為8.98%。見(jiàn)表1。

表1  不同方法大腸埃希菌O157：H7檢測結果

    2.2  大腸埃希菌O157:H7菌株鑒定  檢出的22株可疑菌株均為革蘭陰性無(wú)芽孢短桿菌，生化反應符合大腸埃希菌特征，經(jīng)大腸埃希菌O157、H7診斷血清進(jìn)行玻片凝集反應，確定大腸埃希菌O157:H7菌株１５株，O157:H-菌株７株。送上海市疾病預防控制中心微生物實(shí)驗室進(jìn)行毒素基因測定，結果均為陰性。

   

    3  討論

   

    應用免疫磁珠技術(shù)檢測大腸埃希菌O157:H7在本實(shí)驗室使用的是半自動(dòng)混勻器，所以不僅操作費時(shí)費力，所需時(shí)間較長(cháng)，且免疫磁珠試劑成本較高，不適合大批量的樣品同時(shí)檢測。而PCR技術(shù)能將死菌與含菌量極微的細菌都能檢測出，因此陽(yáng)性率最高，但通過(guò)實(shí)驗發(fā)現有一部分樣品雖然PCR檢測為陽(yáng)性，卻未能通過(guò)分離鑒定到菌株。所以PCR的結果只是定性結論，為陽(yáng)性菌的檢出提供一個(gè)指導方向［3］。因此本課題將PCR技術(shù)和免疫磁珠技術(shù)相結合，利用PCR的快速鑒定，將5個(gè)樣品混合為一個(gè)樣品進(jìn)行檢測，將PCR檢測陽(yáng)性的樣品，再以免疫磁珠法進(jìn)行分離鑒定。這樣既減少了工作量，節約了人力，又降低了試劑成本。

   

    通過(guò)實(shí)驗發(fā)現，用PCR技術(shù)和免疫磁珠技術(shù)相結合的方法檢測大腸埃希菌O157:H7，陽(yáng)性檢出率由用免疫磁珠法的6.12%提高到8.98%，說(shuō)明此方法提高了大腸埃希菌O157:H7的陽(yáng)性檢出率，這對于今后大腸埃希菌O157:H7的監測工作有很大幫助。

   

本次監測分離到的大腸埃希菌O157:H7雖然經(jīng)分析是非產(chǎn)毒株，但都證實(shí)了大腸埃希菌O157:H7在奉賢地區的存在，具備了大腸埃希菌O157:H7感染的客觀(guān)因素，不容小視。而攜帶病原菌的家畜糞便可通過(guò)各種途徑污染食品、飲水和蔬菜，是重要的傳染源［4］。因而，今后應加強對畜牧場(chǎng)的大腸埃希菌O157:H7的監測工作，加強消毒，嚴防糞便污染，環(huán)境尤為重要。

 

作者：沈莉，謝曉紅，韓華忠 《中華醫學(xué)研究雜志》

【參考文獻】

1  季曉輝.腸出血性大腸埃希氏埃希菌的鑒定與檢測.國外醫學(xué)·衛生學(xué)分冊，1997，24(3):174-177.

2  朱姝媛，徐慶，李剛山，等.大腸埃希菌O157: H7的分離鑒定及應用復合PCR法同時(shí)檢測其三個(gè)毒力因子.中國衛生檢驗雜志，2004，14(4):445-446.

3  顧鳴，韓偉.復合PCR鑒定沙門(mén)菌的方法.中國衛生檢驗雜志，2003，13(2):154-157.

4  冉陸.腸出血性大腸埃希菌(EHEC)流行趨勢.中國食品衛生雜志，1999，3:31-35