白色念珠菌細胞壁β-葡聚糖升白細胞藥效學(xué)作用的研究

【摘要】  目的  研究白色念珠菌（Candida Albicans）細胞壁不同溶解性的β-葡聚糖（β-glucan）對環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，endoxan，cytoxan，CTX）所致小鼠外周血白細胞減少的回升作用。方法  采用CTX所致的小鼠外周血白細胞減少模型，研究白色念珠菌細胞壁β-葡聚糖對小鼠外周血白細胞數的影響。結果  三種溶解性的白色念珠菌細胞壁β-葡聚糖均能升高小鼠外周血白細胞、中性粒細胞和單核細胞數。各組小鼠脾臟指數增加，脾臟、骨髓巨核細胞系增生。不溶性的β-葡聚糖作用更明顯。結論  白色念珠菌β-葡聚糖尤其是不溶性β-葡聚糖對CTX所致的白細胞減少有回升作用，是一種很有前途的免疫調節劑。   

    【關(guān)鍵詞】  白色念珠菌；β-葡聚糖；生物學(xué)活性；提取分析；免疫藥理作用      

    【Abstract】  Objective  To study the pharmacological effect of the basic β-glucan，acidic β-glucan and insoluble β-glucan extracts of Candida albicans on the leukocytopoiesis-promoting in the leukopenia mice.Methods  Mice of each group except the untreated control group were administered cyclophosphamide intraperitoneally ［100 mg/(kg·d) for three days］ to develop leucopenia.The experimental group were administered three kinds of Candida albicans β-glucan intravenously for six days separately.The peripherial leukocytes of all mice were counted before treated CTX，and 1，3，5，7 days after treated CTX.Results  Three kinds of Candida albicans β-glucan can increase the numbers of leukocytes，neutrophilic granulocytes and monocytes in the peripheral blood.The spleen index in each group animal are increased，and megakaryocytes are increased in spleen and marrow.Conclusion  Candida albicans β-glucan specially insoluble β-glucans is a kind of immunomodulator which can increase the numbers of leukocytes in the peripheral blood.   

    【Key words】  β-glucan；Candida albicans；leukocyte；immunomodulator   

    β-葡聚糖（β-glucan）是白色念珠菌細胞壁中含量最高的多糖。作為一類(lèi)條件致病真菌多糖，白色念珠菌β-葡聚糖有著(zhù)多種生物學(xué)活性和免疫藥理學(xué)作用，在抗炎、抗腫瘤、刺激造血等方面都有很高的藥效學(xué)作用［1］，但有關(guān)不同性質(zhì)的白色念珠菌β-葡聚糖升白細胞作用的研究甚少。本研究制備三種溶解性的β-葡聚糖，觀(guān)察其對環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，endoxan，cytoxan，CTX）所致的小鼠外周血白細胞減少的回升作用，為進(jìn)一步確證白色念珠菌β-葡聚糖刺激造血系統使白細胞升高的作用機制，和進(jìn)一步研究白色念珠菌β-葡聚糖有效成分或有效因子，為確立藥物質(zhì)量控制標準和量－效關(guān)系提供理論依據。   

    1  材料與方法   

    1.1  動(dòng)物與試劑  昆明種小白鼠，4～6周齡，體重20±2g，昆明醫學(xué)院動(dòng)物科（云南省實(shí)驗質(zhì)量合格證0000481號）。沙氏液體培養基（Sabouraud’s dextrose agar）：蛋白胨10g、葡萄糖40g、溶于1000ml蒸餾水，高壓滅菌后備用；α淀粉酶：分子量～9600，酶活力：50μ/mg（上海伯奧生物科技有限公司）；白色念珠菌堿溶性β-葡聚糖（Candida albicans basic β-glucan， CABBG）、酸溶性β-葡聚糖（Candida albicans acidic β-glucan， CAABG)和不溶性β-葡聚糖（Candida albicans  insoluble β-glucan， CAIBG）：均按文獻方法制備［2］。   

    1.2  儀器  LRH-250Z型震蕩培養箱（廣東醫療器械廠(chǎng)）；81-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂(lè )儀器廠(chǎng)）。   

    1.3  白念珠菌的培養和三種白色念珠菌β-葡聚糖的制備  取少量保存于密封無(wú)菌容器中的純白色念珠菌菌落，接種于沙氏液體培養基，接種后37℃恒溫搖床160次/min震蕩培養6～7天，3000rpm離心30min，收集菌體，冷凍保存。提取β葡聚糖的流程，見(jiàn)圖1。   

    1.4  小鼠白細胞減少模型的建立  除空白對照組外，各組小鼠腹腔注射CTX 100mg/(kg·d)，連續3天，建立小鼠外周血白細胞減少模型。   

    1.5  確定三組β-葡聚糖的給藥劑量  參照急性毒性實(shí)驗摸索LD50值，各組給藥劑量最后如表1。   

    1.6  統計學(xué)處理  急性毒性學(xué)實(shí)驗結果采用Bliss法計算LD50值。藥效學(xué)實(shí)驗采用SPSS11.5統計軟件進(jìn)行數據處理分析，所有指標均以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有顯著(zhù)性。 

圖1  從白色念珠菌提取CABBG、CAABG、CAIBG的流程示意圖

Table 1  Dose design of experiment 

     2  結果   

    2.1  急性毒性學(xué)實(shí)驗  通過(guò)急性毒性實(shí)驗得到LD50值分別為：CABBG 36.8937mg/kg，CAABG 89.23549mg/kg，CAIBG 767.7753mg/kg；95%可信區間分別為CABBG組32.0052～42.5289mg/kg，CAABG組76.7182～103.8025mg/kg，CAIBG組663.748～888.106mg/kg。各實(shí)驗組小鼠肉眼觀(guān)察，除肝臟增大外未見(jiàn)明顯變化，病理HE切片顯示肝細胞有不同程度的腫脹和空泡變。   

    2.2  外周血白細胞變化  實(shí)驗第5、7、9天CABBG、CAABG、CAIBG組小鼠外周血白細胞數、中性粒細胞數、單核細胞數均顯著(zhù)增高，其中第7天、第9天，CAIBG組白細胞數、單核細胞數較陽(yáng)性對照組rhG-CSF升高，差異有顯著(zhù)性。

    2.3  脾臟、胸腺指數變化  實(shí)驗第5、7、9天，各組小鼠胸腺指數比較，差異無(wú)顯著(zhù)性(P＞0.05)。各組小鼠給藥后，脾臟指數均增加。 

    2.4  藥效學(xué)實(shí)驗病理組織學(xué)改變  脾臟：白髓、紅髓分界不甚清楚，紅髓內細胞數增多，與空白對照組比較，CABBG、CAABG、CAIBG組脾竇出現較多的巨核細胞；骨髓：實(shí)驗組小鼠骨髓細胞增生活躍，與空白對照組比較，CABBG、CAABG、CAIBG組的巨核細胞數增多，提示巨核細胞系增生活躍。   

    3  討論   

    多能造血干細胞具有多向分化的潛能，成年小鼠體內的多能造血干細胞主要分布在脾臟和骨髓［3］。本研究顯示，實(shí)驗第7天時(shí)，各實(shí)驗組白細胞總數、中性粒細胞數都較rhG-CSF高(P＜0.05)；實(shí)驗第7天、第9天，CAIBG升高外周血白細胞、單核細胞數明顯高于CABBG、CAABG和rhG-CSF(P＜0.05)，說(shuō)明β-葡聚糖，尤其是CAIBG可刺激血液系統白細胞、中性粒細胞、單核細胞數不同程度的升高。實(shí)驗第7天，CABBG、CAABG、CAIBG組小鼠脾臟指數均與rhG-CSF差異有顯著(zhù)性(P＜0.05)；第9天，CAIBG脾臟指數較rhG-CSF、CABBG、CAABG組高，統計學(xué)表明差異均具有顯著(zhù)性(P＜0.05)。與成年小鼠體內造血干細胞的分布一致，實(shí)驗發(fā)現CABBG、CAABG、CAIBG組小鼠的組織病理學(xué)改變主要體現在骨髓和脾臟。與空白對照組比較，三組小鼠脾臟、骨髓巨核細胞數增多，CAIBG組要更明顯。因此，綜合外周血細胞數、脾臟指數、組織改變，我們推測β-葡聚糖在刺激小鼠外周血白細胞總數升高的過(guò)程中可能與刺激CFU-S增殖，向粒系、巨核系組細胞分化，進(jìn)而生成粒細胞、單核細胞。   

    造血器官中基質(zhì)細胞是造血微環(huán)境中重要的成分，與造血有關(guān)的基質(zhì)細胞涉及到巨噬細胞、成纖維細胞、網(wǎng)狀細胞、淋巴細胞、內皮細胞和載脂肪細胞。其中，巨噬細胞被證明是在造血發(fā)生過(guò)程中有重要作用的一個(gè)微環(huán)境因素。巨噬細胞可通過(guò)細胞相互作用和分泌CSF、Epo、BPA、PGE和IL-1因子，調節所有四系血細胞的生長(cháng)和分化［4］。以往研究證實(shí)念珠菌多糖可刺激巨噬細胞釋放細胞因子（CK）如IL-6、IL-8、IL-1、TNF等［5，6］。這些細胞因子可調控造血細胞的增殖活動(dòng)：IL-1、TNF可刺激內皮細胞產(chǎn)生粒細胞集落刺激因子（G-CSF）及粒-巨噬系集落刺激因子（GM-CSF），G-CSF 和GM-CSF是使粒細胞和單核細胞的母細胞增殖分化的特異性誘導劑，并能刺激骨髓向外周血液釋放成熟的中性粒細胞，縮短中性粒細胞的成熟期［7］。同時(shí)，CSF可作用于粒-單系祖細胞（CFU-GM），誘導其增殖分化。IL-1還能激活干細胞從G0期進(jìn)入增殖周期，擴大干細胞池；可為早期干細胞對CSF起反應做準備，并誘導輔助細胞產(chǎn)生CSF及其他CK，從而間接調節造血。   

    β-葡聚糖是念珠菌重要的抗原決定簇［8］，單核細胞、巨噬細胞上都存在β-葡聚糖的特異性受體［9］。白色念珠菌的三種溶解性的β-葡聚糖，在結構上都是符合單核細胞、巨噬細胞上β-葡聚糖受體對于配體的要求，即能被特異識別β-（1→3）和β-（1→6）糖苷鍵［10］。巨噬細胞作為一類(lèi)抗原遞呈細胞（APC）攝取β-葡聚糖抗原，隨后誘導性的表達高水平MHC，MHC與Th細胞上的TCR和CD4相互作用。使Th細胞功能增強，IL-2分泌增多，IL-2又能保持T細胞的存活與增殖Th細胞被激活后刺激B細胞分化、增殖［11］。實(shí)驗中，小鼠脾臟指數的明顯增加、脾臟、骨髓細胞增生，說(shuō)明了β-葡聚糖在升高外周血白細胞的同時(shí)，也對激活機體的整個(gè)免疫系統活性產(chǎn)生影響。因此，CAABG、CABBG、CAIBG升高小鼠外周血白細胞總數、中性粒細胞和單核細胞的作用可能與各組β-葡聚糖能不同程度的被單核、巨噬細胞識別從而產(chǎn)生一系列細胞因子，刺激造血系統和促進(jìn)中性粒細胞增殖有關(guān)。   

免疫調節劑作為一種免疫治療的藥物已經(jīng)廣泛應用于臨床。多糖作為一類(lèi)免疫調節劑，不僅毒副作用小，資源豐富，而且具有明顯的調節機體免疫系統的作用。本研究說(shuō)明白色念珠菌β-葡聚糖尤其是不溶性的β-葡聚糖能顯著(zhù)增加小鼠脾重，并能對抗由CTX所致的小鼠脾臟萎縮及白細胞水平降低，是一種較好的免疫增強物質(zhì)。

作者：崔 進(jìn)，寧 莉  《昆明醫學(xué)院學(xué)報》

【參考文獻】

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