多重耐藥銅綠假單胞菌β－內酰胺類(lèi)相關(guān)耐藥基因研究

【摘要】 目的 調查我院2005年臨床分離多重耐藥銅綠假單胞菌(PA)的耐藥性分析并探討其耐藥基因的存在狀況。方法 對31株臨床分離的銅綠假單胞菌用紙片擴散法檢測其藥敏表型，采用聚合酶鏈反應(PCR)法檢測β-內酰胺酶編碼基因和外膜通道蛋白OprD2基因，并與相關(guān)藥敏表型比較。結果 31株銅綠假單胞菌對16種抗菌藥物的耐藥率為48．4%~100%；β-內酰胺酶編碼基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的檢出率分別為6．4%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%，未檢出GES、SHV、VER基因，31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失，檢出率為100%。結論 本院多重耐藥銅綠假單胞菌對β-內酰胺酶類(lèi)抗生素的耐藥主要與外膜通道蛋白OprD2基因缺失有關(guān)。��

　　【關(guān)鍵詞】銅綠假單胞菌；多重耐藥；β-內酰胺酶；聚合酶鏈反應；基因型

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　　【Abstract】 Objective To survey the distribution of aminoglycoside-modifying enzyme genes in multidrug-resistant pseudomonas aeruginosa isolated in our hospital in 2005．Methods The antibiotic susceptibility of 31 different antibiotics of P.aeruginosa was tested by K-B method，and 31 multi-drug resistant strains were screened;β-lactamase genes and the outer membrane protein OprD2 gene were detected by polymerase chain reaction(PCR).Results Resistant rates of 31 strains of P.aeruginas against 16 kinds of antibiotic ranged from 48．4%to 100%;the detection rate of β-lactamase gene PER，VIM，DHA，IMP，TEM and OXA-10 was 6．4%，3．2%，3．2%，3．2%，3．2%and 3．2%respectively，and none of the 31 strains possessed genes of GES，SHV and VER，31 isolate of PA lost the outer membrane protein OprD2 gene.Conclusion Resistance to β-lactam compounds in P.aeruginas of our hospital is related to lost the outer membrane protein.��

　　【Key words】Pseudomonas aeruginosa; Multidrug resistance; β-Lactamases; Polymerase chain reaction; Genes

　　

　　銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是一種重要的條件致病菌，常常引起呼吸道感染、菌血癥、肺炎、泌尿系統感染、燒傷感染和囊性纖維化繼發(fā)感染等多種疾病。2002年全國細菌耐藥性監測網(wǎng)調查顯示：PA的分離率為10．3%，僅次于大腸埃希菌而居第二位^[1]。由于臨床上抗生素的大量使用，銅綠假單胞菌呈現出天然或獲得性多重耐藥性(multidrug resistance，MDR)，給治療造成困難。近年來(lái)，銅綠假單胞菌對3、4代頭孢和亞胺培南在內的多種β內酰胺類(lèi)抗生素及氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥率一直處于一個(gè)比較高的水平，并呈現逐年上升的趨勢^[1-3]。為了解臨床分離多重耐藥的PA中耐藥情況，收集了本院2005年1~12月臨床分離的31株P(guān)A，對其進(jìn)行耐藥性的檢測，并采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測其耐藥相關(guān)基因，結果報告如下。��

　　1 材料��

　　1．1 菌株 來(lái)源于本院2005年1~12月臨床分離的多重耐藥銅綠假單胞菌(MDRP)31株。所有標本均采用法國生物梅里埃公司細菌鑒定儀鑒定菌種。��

　　1．2 質(zhì)控菌株 大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853均購自衛生部臨床檢驗中心。��

　　1．3 MH培養基 采用英國Oxoid公司產(chǎn)品。��

　　1．4 抗生素及藥敏紙片頭孢他啶(30 μg/片，CAZ)、頭孢曲松(30 μg/片，CRO)、亞胺培南(10 μg/片，IMP)、克拉維酸(2 mmol/L，CA)、氯唑西林(2 mmol/L)、美羅培南(10 μg/片，MER)、2-巰基丙酸紙片均購自英國Oxoid公司。��

　　1．5 微生物鑒定系統 VITEK-32法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。��

　　1．6 儀器 DNA擴增儀為美國PE公司產(chǎn)品。��

　　1．7 PCR檢測試劑盒由無(wú)錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。��

　　2 方法��

　　2．1 細菌培養、鑒定和保存細菌培養根據臨床檢驗操作規程按常規方法進(jìn)行，采用VITEK-32全自動(dòng)微生物鑒定系統鑒定結果；將細菌接種于半固體培養基中，37℃培養24 h后置-80℃冰箱保存，以備進(jìn)行分子學(xué)檢測。��

　　2．2 抗生素敏感試驗采用紙片擴散法(K-B法)，結果根據美國臨床實(shí)驗室標準化委員會(huì )(NCCLS)2004年版標準進(jìn)行判斷。��

　　2．3 PCR擴增模板制備挑取菌落置入含100 μl生理鹽水的0．5 ml離心管內，15 000轉/min離心5 min，去上清。加0．05%非離子去污劑NP40 50 μl、200 ng/ml的蛋白酶K 2 μl混勻，55℃水浴1 h，然后95℃水浴5 min，最后10 000轉/min離心30 s，取上清做PCR擴增的模板。��

　　2．4 基因檢測 均為PCR法。PCR擴增產(chǎn)物>500bp熱循環(huán)參數均為：93℃預變性2 min，然后93℃60 s→55℃60 s→72℃60 s，循環(huán)35個(gè)周期，最后一個(gè)72℃延長(cháng)至5 min，其余均為：93℃預變性2 min，然后93℃30 s→55℃30 s→72℃60 s，循環(huán)35個(gè)周期，最后一個(gè)72℃延長(cháng)至5 min。各種靶基因的目的產(chǎn)物長(cháng)度見(jiàn)表1。�� 　　

　　2．5 擴增產(chǎn)物檢測 擴增產(chǎn)物在1．5%瓊脂糖凝膠(含0．5 μg/ml溴化乙錠)120 V電泳30~40 min，全自動(dòng)凝膠圖像成像儀觀(guān)察，出現與陽(yáng)性模板分子量相同的條帶即為陽(yáng)性，PCR檢測陽(yáng)性對照DNA，由無(wú)錫市克隆遺傳技術(shù)研究所微生物DNA收集與保存室提供，擴增條件同上。

3 結果��

　　3．1 藥敏試驗結果 31株銅綠假單胞菌對16種抗菌藥物的藥敏率見(jiàn)表2。 　　

　　3．2 基因檢測結果 β內酰胺酶編碼基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的檢出率分別為6．4%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%，未檢出GES、SHV、VER基因，31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失，檢出率為100%。��

　 　

　　

　　4 討論��

　　研究發(fā)現，PA對β內酰胺類(lèi)抗生素存在多種耐藥機制，如外膜滲透性降低、泵出機制、由染色體編碼持續高產(chǎn)AmpC酶、產(chǎn)超廣譜β內酰胺酶^[4]以及能水解卡巴培能碳氫酶烯的金屬酶等。IMP是目前用于治療革蘭陰性桿菌感染具有最強抑菌效能的抗生素，對產(chǎn)ESBLs及AmpC酶的革蘭陰性桿菌均有效。IMP耐藥的PA在臨床上具有更大的危險性^[5]。��

　　近年來(lái)隨著(zhù)研究的深入，國內外學(xué)者在PA菌臨床分離株中發(fā)現了多種β內酰胺酶和碳青霉烯酶基因如TEM^[6]、SHV^[6，7]、OXA^[8]、VEB-1、PER^[8，9]、GES、持續高產(chǎn)AmpC酶、IMP^[10]、VIM^[11]、SPM^[12]等。在我國上海、杭州、石家莊、溫州相繼發(fā)現了VEB-1、OXA-10、IMP、PER-1、TEM-1、SHV基因^{[6，8，10]}。這些基因所表達的產(chǎn)物可以水解青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、單酰胺類(lèi)和碳青霉烯類(lèi)抗生素。��

　　本組菌株中，表型耐亞胺培南的共31株(占100%)，其中外膜通道蛋白OprD2基因缺失為100%；VIM、IPM基因各發(fā)現1株，各占3．2%。PA對亞胺培南耐藥的主要原因為產(chǎn)IMP、VIM、SPM、GIM型金屬β-內酰胺酶、GES-2型β-內酰胺酶和外膜蛋白OprD2缺失等。β內酰胺類(lèi)抗生素對PA的作用靶位是細菌內膜上的PBP2，該類(lèi)藥物要達到其作用靶位必須首先經(jīng)過(guò)外膜通道進(jìn)入周漿間隙。如果菌株外膜蛋白通道減少或缺失，藥物難以到達其作用靶位，細菌將產(chǎn)生耐藥。因此，OprD2被認為是亞胺培南擴散的通道^[11]。VIM、IMP是金屬β-內酰胺酶，可快速水解青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)和碳青酶烯類(lèi)抗菌藥物。通過(guò)本組實(shí)驗研究可以表明PA對亞胺培南耐藥的主要原因是特異性通道OprD2缺失引起外膜通透性降低，從而阻礙抗菌藥物進(jìn)入菌體內到達細菌作用靶位。��

　　OXA、TEM、SHV、PER、GES陽(yáng)性均可引起PA對β內酰胺酶類(lèi)抗菌藥物的廣泛耐藥。本組菌株中PER的陽(yáng)性率為6．4%，TEM、OXA-10的陽(yáng)性率為3．2%，而GES、SHV基因未檢出，這些基因的陽(yáng)性率與國內其他地區的檢測結果有差別^{[6，8，10]}。導致此種結果出現的原因應與本地區抗菌藥物的使用情況有密切關(guān)系。��

　　總之，PA的耐藥機制極為復雜，它對某一類(lèi)抗菌藥物的耐藥往往不是由單一因素造成，而常是幾種機制協(xié)同作用的結果；它對不同抗菌藥物的耐藥機制也不完全相同，并不斷有新的耐藥機制出現。即使是同一種菌不同地區、不同時(shí)期其耐藥性和耐藥基因狀況也不相同。本實(shí)驗結果證明聊城地區的PA對各類(lèi)抗菌藥物均有不同程度的耐藥性，且耐藥基因陽(yáng)性率較有報道的國內其他地區高。OprD2基因缺失應該是本組菌株耐藥的主要原因，此情況應引起臨床醫生和院內感染科的高度重視，但也不排除同時(shí)存在其他耐藥機制的可能，有待進(jìn)一步研究。��

　　作者：李艷華　高恒強　李鵬　張延強《中國實(shí)用醫藥》

　　參 考 文 獻��

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