大腸埃希菌連續分離株耐藥表型及復方磺胺甲口惡唑耐藥相關(guān)基因研究

【摘要】  目的 了解臨床分離的大腸埃希菌耐藥性和復方磺胺甲口惡唑(SMZ/TMP)耐藥相關(guān)基因存在狀況。方法 測定臨床連續分離的60株大腸埃希菌對19種抗菌藥物的敏感性，采用聚合酶鏈反應(PCR)檢測SMZ/TMP耐藥相關(guān)基因(sul1、dfrA1、dfrA17)。結果 60株中sul1、dfrA1、dfrA17基因陽(yáng)性分別為34株(56.7%)、1株(1.7%)、35株(58.3%)。結論 臨床分離的大腸埃希菌多重耐藥嚴重；復方磺胺甲口惡唑耐藥相關(guān)基因攜帶率高。

【關(guān)鍵詞】  大腸埃希菌； 復方磺胺甲口惡唑； 耐藥基因

    ABSTRACT  Objective  To investigate the drug resistance and drug resistance�瞨elated trimethoprim�瞫ulfamethoxazole genes in Excherichia coli.  Method  Microdilution tests were performed to detect susceptibility of 60 strains of Escherichia coli to 19 antimicrobial agents and drug resistance�瞨elated trimethoprim�瞫ulfamethoxazole were detected by PCR.  Result  The positive rates of sul1, dfrA1 and dfrA17 genes in 60 clinical strains of Escherichia coli were 56.7%, 1.7%, 58.3%, respectively.  Conclusions  There are multiple�瞕rug resistance and high positive rate of drug resistance�瞨elated trimethoprim�瞫ulfamethoxazde genes in Escherichia coli isolated from the hospital.

    KEY WORDS  Escherichia coli;  Trimethoprim�瞫ulfamethoxazole;  Resistant genes

      多年來(lái)，大腸埃希菌(Escherichia coli，EC)一直是醫院感染的重要病原菌之一。EC菌對β��內酰胺類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)在內的常用抗菌藥物出現多重耐藥性，相關(guān)耐藥基因研究已有報道。經(jīng)檢索國內尚無(wú)EC菌的復方磺胺甲口惡唑(SMZ/TMP)耐藥相關(guān)基因報道。我們對60株連續分離株EC菌進(jìn)行了藥敏表型檢測，并進(jìn)行了SMZ/TMP耐藥相關(guān)基因sul1、dfrA1、dfrA17檢測，現報道如下。

    1  材料與方法

    1.1  菌株來(lái)源    60株EC菌均分離自2006年08月～2006年12月間麗水市人民醫院住院患者臨床標本，其中痰液10例，尿液24例，血液2例，分泌物24例(膿液15例、腹水4例、引流液3例、咽拭子2例)。全部菌株用Bio�睲erieux ATB細菌鑒定儀鑒定菌種。標準菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

    1.2  抗菌藥物敏感性試驗

    用微量肉湯稀釋法測定19種抗菌藥物的敏感性，并根據美國CLSI 2006年版要求進(jìn)行敏感性判斷。

    1.3  細菌處理    挑純培養菌落置入0.5ml離心管內(內預置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl)，56℃水浴2h，然后95℃水浴10min，加入Chelex 100樹(shù)酯40μl，離心(15000r/min)30s。上清液即為基因檢測的模板液，-20℃冰箱保存備用。

    1.4  基因檢測

    用聚合酶鏈反應法(PCR)進(jìn)行檢測。PCR引物序列見(jiàn)表1。PCR擴增體系為：每反應體系P1、P2引物各0.5μmol，dNTPs各200mmol，KCl 10mmol，(NH4)2SO4 8mmol，MgCl2 2mmol，Tris�睭Cl(pH9.0) 10mmol，NP40 0.5%，BSA 0.02%(wt/vol)，Taq DNA pol 1U；總反應體積20μl(其中模板液5μl)。熱循環(huán)參數為：93℃預變性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循環(huán)35周期，再72℃延伸5min。耐藥基因檢測試劑盒、靶基因PCR引物序列和陽(yáng)性對照DNA由無(wú)錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供(表1)。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠電泳成像儀下觀(guān)察，并紀錄結果。表1 sul1、dfrA1、dfrA17基因PCR引物序列及產(chǎn)物長(cháng)度

    2  結果

    2.1  藥敏試驗結果

    60株EC菌連續分離株對亞胺培南和美羅培南敏感。對頭孢他啶、阿莫西林/克拉維酸、頭孢西丁、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/三唑巴坦等6種抗菌藥物的敏感率在53.3%～95%；對頭孢噻肟、頭孢呋辛、妥布霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、哌拉西林、阿莫西林和替卡西林等8種抗菌藥物的耐藥率在50%～90%。對復方磺胺甲口惡唑的耐藥率為66.7%。

    2.2  sul1、dfrA1、dfrA17基因

    sul1、dfrA1、dfrA17基因陽(yáng)性率分別為56.7%(34/60)、1.7%(1/60)、58.3%(35/60)。有35株檢出dfrA基因(58.3%)，40株檢出sul和(或)dfrA基因(66.7%)。圖1為sul1基因PCR產(chǎn)物電泳圖。dfrA17基因PCR產(chǎn)物經(jīng)測序與美國GenBank核酸數據庫中已登錄的dfrA17基因序列完全一致。

3  討論

    EC菌廣泛分布于自然界、健康人的皮膚、腸道和呼吸道。正常情況下，EC菌并不感染人體的任何組織，但當人體免疫力降低、長(cháng)期大量使用廣譜抗菌藥物或創(chuàng )傷性醫療操作等情況下易引起內源性感染。EC菌所致感染中以泌尿道感染、呼吸道感染、菌血癥等最常見(jiàn)。

    復方磺胺甲口惡唑為磺胺甲基異口惡唑(sulfame�瞭hoxazole，SMZ)與甲氧芐胺嘧啶(trimethoprim，TMP)的復合制劑，磺胺的抑菌機制為與化學(xué)結構相似的對氨苯甲酸(PABA)競爭二氫葉酸合成酶(DHPS)，使二氫葉酸合成減少；甲氧芐胺嘧啶能抑制二氫葉酸還原酶(DHFS)，使四氫葉酸的生成受阻�；前匪幣c甲氧芐胺嘧啶合用后，分別作用于細菌葉酸合成的不同環(huán)節，因而有協(xié)同作用［1］。近年來(lái)，對細菌的可移動(dòng)性遺傳元件研究發(fā)現，I類(lèi)整合子的耐藥基因盒中常攜帶二氫葉酸合成酶的編碼基因sul1，有些同時(shí)還攜帶二氫葉酸還原酶的編碼基因dfrA(早期文獻中以dhfr表示)［2～4］。細菌額外獲得sul1基因，所表達的二氫葉酸合成酶抵消了磺胺與PABA競爭性抑制作用，導致細菌耐磺胺。細菌額外獲得dfrA基因，所表達的二氫葉酸還原酶補充了甲氧芐胺嘧啶靶位酶，導致細菌耐甲氧芐胺嘧啶。

    為了解EC菌復方磺胺甲口惡唑耐藥相關(guān)基因存在狀況，我們根據美國GenBank核酸數據庫中已發(fā)布的腸桿菌I類(lèi)整合子基因序列，自行設計了sul1、dfrA1、dfrA17基因PCR擴增引物。結果顯示有40株檢出sul和(或)dfrA基因(66.7%)，表型與基因型基本相符。對臨床連續分離EC菌的復方磺胺甲口惡唑(SMZ/TMP)耐藥相關(guān)基因的專(zhuān)題研究國內為首次報道。

1996年，在O139群霍亂弧菌中發(fā)現一種整合性接合元件，該元件整合于細菌染色體上(長(cháng)約100kbp)編碼對磺胺甲基異口惡唑與甲氧芐胺嘧啶的抗性，被稱(chēng)為SXT元件［5］。SXT元件不僅存在于霍亂弧菌中，其它細菌內也有發(fā)現［6］。EC菌是否存在SXT元件需要進(jìn)一步研究。

作者：王偉 糜祖煌 毛劍鋒 徐偉珍  《中國抗生素雜志》 

【參考文獻】

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