5株第一類(lèi)整合子陽(yáng)性銅綠假單胞菌的耐藥機制分析

【摘要】  目的 了解5株分離于臨床的第一類(lèi)整合子陽(yáng)性銅綠假單胞菌分子生物學(xué)特點(diǎn)。方法應用PCR的方法確定5株銅綠假單胞菌含有第一類(lèi)整合子并且對其整合耐藥基因盒進(jìn)行擴增和測序，通過(guò)PFGE分析該5株菌的同源性。結果 5株銅綠假單胞菌均為第一類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株并且都攜帶2360bp的耐藥基因盒，包括aacA4和含有終止突變的cmlA1。PFGE結果顯示5株銅綠假單胞菌來(lái)自同一克隆。結論整合子在臨床致病菌的多重耐藥性中起著(zhù)重要作用，本研究提示應加強細菌耐藥性的監測以及防止相關(guān)病菌在院內的傳播。

【關(guān)鍵詞】  整合子； 銅綠假單胞菌； PFGE

目前，對細菌耐藥機制的研究已成為研究的熱點(diǎn)。攜帶耐藥基因是細菌顯示耐藥性的重要原因之一。耐藥基因主要可以通過(guò)質(zhì)粒、轉座子和整合子等進(jìn)行水平傳播，其中整合子水平式傳播是介導革蘭陰性菌特別是腸道菌和假單胞菌屬細菌多重耐藥的重要原因�，F已確認至少有9種整合子，但是起最主要作用的為第一類(lèi)整合子［1，2］。第一類(lèi)整合子主要由兩個(gè)保守端以及在保守端之間的耐藥基因盒組成。5′��保守端有編碼整合酶的intI1基因及啟動(dòng)子，大多數3′��保守端有三個(gè)ORF：編碼耐季銨鹽化合物及溴乙錠的耐藥基因(qacE△1)、耐磺胺耐藥基因(sulI)和功能不明的ORFu。整合子在整合酶的催化下，通過(guò)整合酶在59bp的特定識別位點(diǎn)，將游離的耐藥基因盒整合到自身。耐藥基因盒中的耐藥基因不能自身表達，當它整合到整合子后，在整合子5′��保守區域的啟動(dòng)子的作用下得到表達，使細菌顯示出耐藥性。一些數據表明細菌整合子可以攜帶多個(gè)耐藥基因盒，同時(shí)對多種抗生素產(chǎn)生抗性。因此研究整合子介導的細菌耐藥機制，對研究細菌的多重耐藥有非常重要的意義。

    本文對5株臨床分離的第一類(lèi)整合子陽(yáng)性銅綠假單胞菌的耐藥基因盒進(jìn)行檢測，分析其耐藥基因，并對其相關(guān)的同源性進(jìn)行比較。進(jìn)一步討論條件致病菌在院內的傳播以及整合子在細菌耐藥中的介導作用。

    1  材料和方法

    1.1  實(shí)驗用菌株

    實(shí)驗所用的5株銅綠假單胞菌均分離自2006年暨南大學(xué)附屬第一醫院患者樣本。第一類(lèi)整合子陽(yáng)性對照菌株為V.cholerae O1 SK 10，由丹麥皇家畜牧獸醫和農業(yè)大學(xué)獸醫微生物學(xué)研究室Anita Forslund博士惠贈；第一類(lèi)整合子陰性對照菌株為E.coli C600由日本大阪府立大學(xué)國際防疫學(xué)研究室山崎伸二教授惠贈。

    1.2  細菌培養鑒定及藥敏試驗

    法國Bio�睲erieux公司全自動(dòng)微生物分析儀(Vitek��32型)鑒定，藥敏試驗采用紙片擴散法，藥敏紙片及MH培養基由英國Oxiod公司生產(chǎn)，根據推薦方案選用藥敏紙片。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、金葡菌ATCC25923和銅綠假單胞菌ATCC27853�？股�素紙片有阿米卡星(AMK)、氨曲南(AZ)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢哌酮(CPZ)、氯霉素(CHL)、環(huán)丙沙星(CPLX)、頭孢曲松(CRO)、頭孢噻肟(CTX)、 頭孢吡肟(CPE)、 慶大霉素(GM)、 亞胺培南(IPM)、哌拉西林(PIPC)、復方磺胺甲口惡唑(SMZ/TMP)和妥布霉素(TOB)共14種。藥敏方法和結果判斷參照CLSI(2006)標準。

    1.3  DNA模板的制備和引物的設計

    菌株DNA提取參照文獻［3］，用SDS溶液裂解細胞，用蛋白酶K水解蛋白質(zhì)，酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提蛋白，冷凍無(wú)水乙醇沉淀DNA，最后用TE緩沖液(pH8.0)溶解。取1μl作為DNA模板進(jìn)行PCR反應。引物分別用來(lái)擴增整合酶基因intI，耐藥基因盒的引物見(jiàn)表1。

    1.4  PCR反應

    50μl反應總體積的組成：10×PCR緩沖液5μl，引物各3μl，dNTP 4μl，DNA模板1μl，無(wú)菌去離子水33.75μl，0.25μl Taq DNA聚合酶(5U/μl，TaKaRa生物工程公司)。PCR反應儀為ABI 2700。intI1擴增循環(huán)條件：裂解溫度94℃ 5min，每個(gè)循環(huán)為94℃ 0.5min，52℃ 0.5min，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸7min。耐藥基因盒擴增循環(huán)條件為：94℃ 5min，94℃ 0.5min，52℃ 0.5min，72℃ 2min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。

    1.5  PCR產(chǎn)物的檢測

    取PCR產(chǎn)物5μl在1%的瓊脂糖凝膠上100V電泳25min，EB溶液染色10min，水洗10min，BIO�睷AD凝膠成像系統照相檢測。

    1.6  耐藥基因盒擴增產(chǎn)物的純化、測序及序列分析

    用耐藥基因盒特異性引物in�睩和in�睟擴增得到的產(chǎn)物使用separations spin colums(Princeton separation公司)和MBI Fermentas Gel Extraction Kit(MBI Fermentas公司)按照指導說(shuō)明進(jìn)行純化，連接到pGM�睺載體(Promega)，轉化至DH5α以供測序及后續研究使用。使用Genetyxversion 7.0(Software Development公司)軟件以及在www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站對序列進(jìn)行分析，應用標準核苷酸BLAST對獲得的基因片段進(jìn)行同源性檢索。

    1.7  脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)

    試劑和方法按文獻［4］進(jìn)行。細菌在L培養基中培養到A600為0.8～1.0，將菌體溶解在低熔點(diǎn)凝膠(BioRad公司)中，用溶菌酶溶解液將菌體溶解，用50U的XbaI酶(TaKaRa)過(guò)夜消化凝膠栓中的基因組DNA，然后按廠(chǎng)家說(shuō)明將凝膠栓放入嵌位均勻電場(chǎng)電泳儀(CHEF Mapper，Bio2Rad公司)于14℃電泳40h，而后在EB溶液中染色10min，水洗10min，在BIO�睷AD

    表1        本實(shí)驗用以擴增第一類(lèi)整合酶和耐藥基因盒的引物

    引物類(lèi)型引物系列    靶位注冊號參考文獻  INT��1U5′�睞CGAGCGCAAGGTTTCGGT��3′Y18050本文  INT��1D5′�睪AAAGGTCTGGTCATACATG��3′intI1Y18050本文  in�睩5′�睪GCATACAAGCAGCAAGC��3′耐藥基因U123385  in�睟5′�睞AGCAGACTTGACCTGAT��3′U123385

    凝膠成像系統照相檢測。

    2  結果

    2.1  菌株的藥敏檢驗結果

    藥敏實(shí)驗結果表明5株銅綠假單胞菌均為多重耐藥菌，且對頭孢他啶、頭孢哌酮、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、頭孢噻肟、慶大霉素、哌拉西林、復方磺胺甲口惡唑和妥布霉素都顯示出耐藥性，結果見(jiàn)表2。

    2.2  第一類(lèi)整合子檢測結果

    5株銅綠假單胞菌在用INT��1U和INT��1D(表1)這對引物擴增第一類(lèi)整合酶基因(intI)時(shí)，均得到了565bp的擴增產(chǎn)物，與理論相符合，確定為第一類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株。

    2.3  耐藥基因盒序列分析

    對5株第一類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株用in�睩和in�睟特表2    5株銅綠假單胞菌藥敏結果異性引物擴增其整合的耐藥基因，結果從5株菌株均可以得到2360bp的PCR產(chǎn)物(圖1)。選取該5株菌中P10所擴增的2360bp片段進(jìn)行測序，序列分析表明該片段含aacA4耐藥基因盒和cmlA1耐藥基因盒，其中aacA4編碼對氨基糖苷類(lèi)抗生素如卡那霉素、妥布霉素的耐藥性，而其攜帶的cmlA1基因盒中的cmlA1基因在267位的核苷酸有終止突變：GenBank中公布的cmlA1序列(序列號AJ639924)在267位的核苷酸為胸腺嘧啶(C)，而P10的cmlA1序列在267位為鳥(niǎo)嘌呤(G)，使原先的酪氨酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，導致轉錄終止。對其余4株菌的該部分基因盒再次測序均得到與P10相同結果，即cmlA1基因盒中的cmlA1基因均有同樣的終止突變。所以該突變cmlA1不能編碼相關(guān)蛋白質(zhì)。

2.4  PFGE結果

    PFGE結果顯示5株銅綠假單胞菌P5、P6、P10、P14和P26的條帶完全一致，PFGE結果相同，說(shuō)明5株PA來(lái)自同一克隆。

    2.5  GenBank注冊號碼

    所測序的2360bp片斷在GenBank的注冊號碼為AB214531。

    M: DL2000 marker；  1：P5；  2：P6；  3：P10；  4： P14；  5：P26

    圖1    引物in�睩 and in�睟 PCR反應產(chǎn)物電泳圖

    3  討論

    目前，整合子系統對于研究細菌的耐藥性顯得尤為重要［6］。來(lái)自臨床的耐藥菌株中，整合子的陽(yáng)性率在50%以上［2，7，8］。同時(shí)，在畜牧業(yè)和環(huán)境等各方面分離出來(lái)的菌株也有整合子介導的耐藥菌株存在。在院內感染分離出來(lái)的菌株中，由于患者抵抗能力差，致病菌在患者體內存活時(shí)間長(cháng)，因此在多種抗生素的選擇壓力下容易形成多重耐藥菌株。為此，研究院內感染細菌的耐藥性十分重要，對于治療和新型抗生素的研發(fā)有一定指導作用。

    銅綠假單胞菌是院內獲得性感染的常見(jiàn)致病菌，耐藥率高、耐藥機制復雜，并且有逐年增多的趨勢。在該5株第一類(lèi)整合子陽(yáng)性的銅綠假單胞株中均攜帶aacA4的耐藥基因。aacA4是編碼對氨基糖苷類(lèi)抗生素產(chǎn)生抗性的耐藥基因，它在第一類(lèi)和第三類(lèi)整合子中均有發(fā)現［2］。同時(shí)，據報道，編碼氨基糖苷類(lèi)的耐藥基因盒為最常見(jiàn)的一類(lèi)耐藥基因盒，目前至少有14種耐氨基糖苷類(lèi)的基因盒已經(jīng)被發(fā)現［9］。但是，aacA4編碼的蛋白并非對所有種類(lèi)的氨基糖苷類(lèi)藥物均耐藥，因為aacA4編碼的是氨基糖苷6′�睳��乙酰轉移酶［AAC(6′)�睮或II］，所以并不產(chǎn)生對大觀(guān)霉素和鏈霉素這類(lèi)氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥性。通過(guò)BLAST分析，在該整合子攜帶的aacA4基因屬于aac(6′)�睮b，它編碼的蛋白是AAC(6′)的第一亞類(lèi)，即AAC(6′)�睮。據相關(guān)報道，aac(6′)�睮b可以產(chǎn)生對妥布霉素、卡那霉素和阿米卡星的抗性，對慶大霉素的抗性不明顯［10］。但是從藥敏實(shí)驗的結果來(lái)看，5株銅綠假單胞菌均對妥布霉素和慶大霉素耐藥，阿米卡星對P10、P14與P26為中介，P5和P6則為敏感。出現這種結果的原因可能有很多，首先，整合子內耐藥基因的表達機制還未能完全闡明清楚。其次，細菌對氨基糖苷類(lèi)抗生素產(chǎn)生抗性的原因有很多，除了酶修飾的作用外，還有細菌產(chǎn)生的不滲透性。其中有修飾作用的酶除了氨基糖苷乙酰轉移酶外，還有氨基糖苷磷酰轉移酶、氨基糖苷核苷酸轉移酶。因此，對于細菌的耐藥情況，特別是多重耐藥菌，僅僅從一個(gè)方面考慮是不夠的。另外，目前在臨床上應用的較多的氨基糖苷類(lèi)藥物則為妥布霉素、阿米卡星等，所以隨著(zhù)抗生素應用的變化，耐藥基因盒的種類(lèi)和數量也會(huì )有相應的變化。

    另外，5株銅綠假單胞菌的第一類(lèi)整合子在攜帶aacA4耐藥基因盒的同時(shí)，均攜帶含有終止突變的cmlA1耐藥基因盒，因為該終止突變點(diǎn)在離基因起始位點(diǎn)的第267個(gè)核苷酸處，所以不能轉錄翻譯出完整的蛋白質(zhì)。從藥敏實(shí)驗的結果來(lái)看，5株陽(yáng)性的銅綠假單胞菌均對氯霉素敏感，從表型上證實(shí)cmlA1基因由于終止突變的失效。cmlA1本身是一種編碼對氯霉素的耐藥的基因，它的產(chǎn)物與銅綠假單胞菌的排出泵有關(guān)。低濃度的氯霉素就可以誘導cmlA1的表達；CmA1蛋白主要位于內膜，它可以與某些細菌內源的泵出機制共同作用。在細菌的耐藥機制中，泵出機制也是十分重要的一個(gè)方面。當與細菌排除泵相關(guān)的基因被整合子整合以后，更加有利于細菌耐藥的傳播。同時(shí)也說(shuō)明細菌的耐藥機制并非單獨作用而是相互聯(lián)系的。

由于多重耐藥的菌株在人體內的積累，這種細菌耐藥性的傳播為治療帶來(lái)較大困難，同時(shí)也為傳染病的暴發(fā)及流行提供了可能性。從PFGE的結果可以明顯看出，5株銅綠假單胞菌為同一個(gè)克隆株，由于該5株菌分離自暨南大學(xué)附屬第一醫院同一段時(shí)間內不同患者的樣本，說(shuō)明加強控制院內感染致病菌的重要性。因為導致院內感染的多為條件致病菌，而患者往往抵抗力低，所以應該注意合理布局病房，加強相關(guān)醫療器械和設備特別是呼吸機的消毒，加強醫護人員的無(wú)菌操作等以減低或防止致病菌在院內的傳播。本實(shí)驗通過(guò)對分離自臨床的5株第一類(lèi)整合子陽(yáng)性銅綠假單胞菌相關(guān)特性進(jìn)行分析，說(shuō)明了整合子系統在細菌耐藥機制中的重要性，同時(shí)提示我們需要加強細菌耐藥性的監測以及防止相關(guān)病菌在院內的傳播。

作者：肖增璜 劉菊珍 付強 石磊《中國抗生素雜志》

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