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【摘要】 目的 了解多重耐藥大腸埃希菌(ECO)氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥機制。方法采用PCR檢測20株多重耐藥ECO菌11種16S rRNA甲基化酶和氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因。結果 1株檢出16S rRNA甲基化酶基因(5.0%)，并為新亞型；16株檢出氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因(80.0%)。15號株rmtB基因測得序列翻譯成氨基酸序列與美國核酸庫(GenBank)已登錄的rmtB氨基酸不同，為新亞型。結論 本組多重耐藥ECO菌氨基糖苷類(lèi)耐藥機制與產(chǎn)16S rRNA甲基化酶和產(chǎn)氨基糖苷類(lèi)修飾酶相關(guān)。多重耐藥ECO菌存在新的氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥機制。
【關(guān)鍵詞】 大腸埃希菌； 16S rRNA甲基化酶；氨基糖苷類(lèi)修飾酶
ABSTRACT Objective To investigate mechanism of aminoglycoside resistance in multidrugresistant Escherichia coli. Methods The genes of 11 kinds 16S rRNA methylase and aminoglycosidemodifying enzymes were detected by polymerase chain reaction (PCR). Results In 20 strains, 1 strain carried 16SrRNA methylase gene (rmtB), 16 strains were positive for the genes of aminoglycosidemodifying enzymes. There were changes of aminoacids in the sequence of RmtB of No.15. A significant difference was found from the rest that landed in GenBank, which identified itself as new subtype. Conclusion The aminoglycoside resistance mechanism of the Escherichia coli was closely related with 16S rRNA methylase and aminoglycosidemodifying enzymes. The new mechanism of aminoglycoside resistance was discoved in multidrugresistant strains of Escherichia coli.
KEY WORDS Escherichia coli; 16S rRNA methylase; Aminoglycosidemodifying enzymes
大腸埃希菌(ECO)是條件致病菌，對β內酰胺類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)在內的常用抗菌藥物呈多重耐藥性。有關(guān)ECO菌耐藥機制研究，國內報道β內酰胺類(lèi)耐藥機制較多，報道氨基糖苷類(lèi)耐藥機制較少，并僅限于6種氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因存在情況［1～4］。近年來(lái)，國外學(xué)者發(fā)現了氨基糖苷類(lèi)耐藥新機制——16S rRNA甲基化酶(編碼基因為rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和armA)［5～8］。為盡可能了解淮安市第一人民醫院ECO菌臨床分離多重耐藥株氨基糖苷類(lèi)藥物各種耐藥相關(guān)基因存在狀況，我們檢測了16S rRNA甲基化酶與氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、armA、aac(3)I、aac(3)II、aac(6′)Ib、aac(6′)II、ant(3")I和ant(2")I，現報告如下。
1 材料與方法
1.1 菌株來(lái)源
20株ECO菌株均分離自2007年1～7月間淮安市第一人民醫院住院患者標本。標本來(lái)源分別為尿液7株、痰液5株、血液5株、膿液3株；患者年齡2～75歲，男7例、女13例。全部菌株均使用VITEK32全自動(dòng)微生物鑒定系統鑒定菌種。標準菌株為大腸埃希菌ATCC25922。
1.2 抗菌藥物敏感性試驗
用KB法測定18種抗菌藥物的敏感性。根據美國CLSI 2006年版標準進(jìn)行敏感性判斷。頭孢哌酮/舒巴坦參照頭孢哌酮。20株多藥耐藥臨床分離ECO菌對18種抗菌藥物的敏感性見(jiàn)表1。
1.4 細菌處理
挑純培養菌落置0.5ml離心管內(內預置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl)，
1.5 基因檢測
全部采用PCR法，靶基因引物序列和目的產(chǎn)物長(cháng)度見(jiàn)表2。各種靶基因PCR擴增體系均為：每反應體系P1、P2引物各0.5μmmol/L， dNTPs各200表1 20株ECO菌18種抗菌藥物的敏感性表2 靶基因PCR引物序列總反應體積20μl(其中模板液5μl)。PCR擴增產(chǎn)物>500bp熱循環(huán)參數均為：
1.6 陽(yáng)性基因測序
PCR直接全自動(dòng)熒光法(在美國ABI公司3730型儀上進(jìn)行)。
2 結果
20株ECO菌中rmtB基因陽(yáng)性1株(5.0%)；aac(3)II、aac(6′)Ib、ant(3")I基因陽(yáng)性分別為15株(75.0%)、8株(40.0%)、3株(15.0%)，共有16株檢出氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因(80.0%)。20株ECO菌對氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥的各種相關(guān)基因存在狀況見(jiàn)表3。15號株測得rmtBDNA序列翻譯成氨基酸序列與美國核酸庫已登錄的rmtB氨基酸序列比較(Escherichia coli，登錄號：ABW87619)，氨基酸序列98%相同，能判斷為新亞型，已命名為rmtBlike并登錄于美國核酸庫(登錄號：EU409593)。圖1為15號株氨基酸序列比較圖。
3 討論
氨基糖苷類(lèi)藥物自20世紀40年代首次發(fā)現以來(lái)，因其抗菌譜廣、療效卓越，在醫學(xué)臨床和畜牧獸醫業(yè)得到廣泛應用。但由于泛用和過(guò)度使用氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥問(wèn)題隨之凸現，細菌對該類(lèi)藥物耐藥是通過(guò)表316S rRNA甲基化酶、氨基糖苷類(lèi)修飾酶15號株測得rmtB DNA序列翻譯成氨基酸序列與美國核酸庫已登錄的rmtB氨基酸序列比較產(chǎn)氨基糖苷類(lèi)修飾酶、細菌16S rRNA甲基化酶(編碼基因為rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和armA)和氨基糖苷類(lèi)藥物作用靶位16S rRNA基因(16S rDNA)突變或核糖體蛋白編碼基因突變所致以及細菌藥物外排泵表達增強所致［9，10］，其中產(chǎn)氨基糖苷類(lèi)修飾酶為主要原因。氨基糖苷類(lèi)修飾酶按功能可分成乙酰轉移酶(AAC)、磷酸轉移酶(APH)、核苷轉移酶(ANT)［舊稱(chēng)腺苷轉移酶(AAD)］三類(lèi)，目前已發(fā)現的有30余種。本研究20株ECO菌株中檢出rmtB 16S rRNA甲基化酶基因；檢出aac(3)II、aac(6′)Ib和ant(3")I三種氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因，并以aac(3)II和aac(6′)Ib為主。
本組13株慶大霉素和/或阿米卡星耐藥菌均檢出1種以上氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因；1株慶大霉素和阿米卡星霉素均敏感者未檢出氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因；另有3株慶大霉素和/或阿米卡星耐藥者均未檢出氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因，原因可能是藥物作用靶位16SrRNA基因(16S rDNA)突變或核糖體蛋白編碼基因突變所致或細菌藥物外排泵表達增強所致。
過(guò)去，藥物學(xué)家通過(guò)改造老的氨基糖苷類(lèi)藥物的結構改善產(chǎn)氨基糖苷類(lèi)修飾酶細菌的抗菌效能［11，12］，如在卡那霉素分子中引入保護基團以免修飾酶的修飾(如阿米卡星)；或是去除易被修飾酶修飾的基團(如地貝卡星)；或是兩者同時(shí)采用(如阿貝卡星，阿貝卡星能拮抗大多數的修飾酶)�，F在發(fā)現16S rRNA甲基化酶在細菌間快速傳播將堵住通過(guò)改造老的氨基糖苷類(lèi)藥物的結構以拮抗修飾酶和提高抗菌作用開(kāi)發(fā)新藥的路子。因此16S rRNA基因甲基化酶所致的氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥應引起國內同行的足夠關(guān)注。
16S rRNA甲基化酶在東亞(日本、韓國、我國臺灣)、歐洲和南美均有報道［13］。最近，我國動(dòng)物醫學(xué)專(zhuān)家報道了從豬分離到的陰溝腸桿菌中發(fā)現的rmtB［14］。日前我國從多藥耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中查出armA型16S rRNA甲基化酶［15］，本文從ECO菌查出rmtB型16S rRNA甲基化酶為國內首次，并為新亞型。我國ECO菌臨床連續分離株16S rRNA甲基化酶存在狀況值得深入研究。
研究提示，本組ECO菌氨基糖苷類(lèi)耐藥機制與產(chǎn)16S rRNA甲基化酶和產(chǎn)氨基糖苷類(lèi)修飾酶相關(guān)。當然仍不能排除同時(shí)伴有氨基糖苷類(lèi)作用靶位16S rRNA基因突變或核糖體蛋白編碼基因突變以及存在多藥外排機制。
作者：林寧 孫海平 糜祖煌《中國抗生素雜志》
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