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【摘要】 目的 探討銅綠假單胞菌細菌生物膜(biofilm，BF)形成發(fā)展過(guò)程中空間立體結構變化，以及BF形成過(guò)程中與其生物學(xué)行為之間的相互聯(lián)系。方法體外建立6h和1、3及6d等4個(gè)時(shí)間組銅綠假單胞菌PAO1菌株BF模型，通過(guò)綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)標記，結合激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)攝取BF形成發(fā)展各階段不同層面的圖片堆，經(jīng)圖像結構分析軟件(image structure analyer，ISA)分析獲得PAO1菌株BF相關(guān)空間結構參數定量化數據。結果 ①CLSM結合GFP標記，實(shí)現了對PAO1菌株BF動(dòng)態(tài)形成過(guò)程的觀(guān)察；②ISA軟件定量化分析顯示，隨著(zhù)BF發(fā)展，厚度不斷增加，前3d增加程度(19.6μm)明顯大于后3d(6.1μm)，區域孔率(areal porosity，AP)、平均擴散距離(average diffusion distance，ADD)和結構熵(textural entropy，TE)在BF形成的6h和6d分別為：0.98±0.01和0.92±0.02，呈現下降趨勢；1.00±0.009和1.06±0.027，雖變化幅度不大，但亦呈現逐漸增加趨勢；0.7±0.08和4.3±0.09，呈明顯上升趨勢。結論 ISA程序可以表征PAO1菌株BF的空間結構特征，對細菌BF結構的定量化分析也有助于探索BF形成過(guò)程與其生物學(xué)行為之間的相互聯(lián)系。
【關(guān)鍵詞】 生物膜； 銅綠假單胞菌； 定量分析； 結構
ABSTRACT Objective To quantify the sequential development of biofilm spatial structure in biofilm process with Image Structure Analyer (ISA) software, which will provide assistant to further research on the biological behavior of biofilm. Methods P.aeruginosa PAO1 biofilm model in vitro was constructed on glass slice and biofilm development was monitored in different time intervals (6 hours, 1 day, 3 days and 6 days). The fluorescence images stack of different layer in biofilm model were obtained by confocal laser scanning microscopy (CLSM), based on fluorophores from PAO1 with green fluorescent protein (GFP) genetically tagged. Quantitative parameters describing biofilm spatial structure could be acquired after the image information was calculated by ISA software. Results ①The PAO1 biofilm process was investigated successfully by CLSM after genetically tagged with GFP. ②The quantitative data from ISA software showed that the thickness of biofilm accumulated during biofilm growth, the rate was more obvious during the first 3 days than the latter 3 days (19.6μm vs. 6.1μm); meanwhile the areal porosity (AP) decreased from 0.98±0.01 at 6h to 0.92±0.02 at 6d, the average diffusion distance (ADD) increased slightly from 1.00±0.009 at 6h to 1.06±0.027 at 6d; the textural entropy (TE) increased from 0.7±0.08 at 6h to 4.3±0.09 at 6d. Conclusions The ISA software could provide useful information of bacterial biofilm spatial structure in PAO1 biofilm process. Quantifying bacterial biofilm structure permitsed correlating biofilm development with biofilm performance.
KEY WORDS Biofilm; Pseudomonas aeruginosa; Quantitative analysis; Structure
長(cháng)久以來(lái)，人們對細菌的認識停留在浮游態(tài)水平上，但自然界中99%的細菌以生物膜(biofilm，BF)的形式存在。細菌BF是細菌為適應生存環(huán)境黏附惰性或活性材料表面形成的一種與浮游細胞相對應的生長(cháng)方式，具有環(huán)境適應能力更強，抵抗吞噬細胞作用，逃避宿主免疫，尤其耐藥性極強等生物學(xué)特性，而BF的許多特性均與其特殊形態(tài)結構有關(guān)。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是我國醫院和社區獲得性感染及重癥監護病房感染的重要條件致病菌，近年來(lái)研究證明，該菌極易形成BF［1］，臨床上，有BF表型的Pa往往引起難以治愈的嚴重感染。以往研究多采用光鏡、掃描或透射電鏡等觀(guān)察細菌BF結構，但樣本在脫水、固定、染色等處理過(guò)程中易發(fā)生結構扭曲及關(guān)系改變。本實(shí)驗通過(guò)建立體外PaO1菌株BF模型，結合綠色熒光蛋白(GFP)標記技術(shù)，運用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)攝取BF發(fā)展成熟各階段不同層面的圖像，所獲圖片堆經(jīng)圖象結構分析(image structure analyer，ISA)軟件分析，獲得PAO1菌株BF發(fā)展過(guò)程相關(guān)空間結構變化的數據，以期實(shí)現對細菌BF的無(wú)損傷觀(guān)察，并對BF空間結構的定量化分析進(jìn)行了初步探索。
1 材料和方法
1.1 試劑和菌株
銅綠假單胞菌PAO1菌株(本實(shí)驗室保存)，pGFPuv質(zhì)粒(Clontech公司)，質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(日本BioFlux公司)，限制型內切酶EcoRI和HindIII(寶生物公司)，ISA軟件(美國Montana州立大學(xué)Haluk Beyenal教授提供)。
(1)PAO1菌株電感受態(tài)制備 參考單志英等［2］實(shí)驗方法，將過(guò)夜增菌的PAO1菌株轉接于50ml SOB培養基中，
(2)pGFPuv質(zhì)粒轉化和轉化菌株篩選 感受態(tài)細胞100μl，質(zhì)粒約50ng，加入預冷的
(3)轉化菌株中質(zhì)粒提取和酶切電泳鑒定 挑取表達強綠色熒光的轉化菌株單菌落，接種LBroth培養液，
(4)pGFPuv轉化菌株建立BF模型 挑取GFP轉化PAO1菌株單菌落接種LBroth培養液，
1.2 激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察
氬激光(488nm)激發(fā)，物鏡×20，每個(gè)模型由外(BF游離的一面)向內(BF和玻片相貼的一面)逐層掃描(沿Z軸掃描)，每個(gè)標本掃描8～16張。
1.3 運用ISA軟件對PAO1菌株BF結構定量化分析
將上述獲得的各時(shí)間組模型圖片堆調入ISA3D軟件，確認圖片的完整性及順序后運行ISA及ISA3D命令，運行結果包括：①結構參數：如結構熵(textural entropy，TE)、結構能(energy，E)、均一性(homogeneity，H)；②平面參數：區域孔率(areal porosity，AP)、平均擴散距離(average diffusion distance，ADD)、最大擴散距離(maximum diffusion distance，MDD)等指標；③其它參數：如生物量(biovolume，BV)、比表面積(surface area between biomass and void，SA)、單位面積生物膜體積(biomass volume to surface area ratio，V2SA)等［3］。輸出數據以EXCEL格式保存。
2 結果
2.1 GFP標記的PAO1菌株構建與發(fā)光表型觀(guān)察
通過(guò)電轉化方法對PAO1菌株進(jìn)行了pGFPuv標記。轉化菌株自然光下即可見(jiàn)綠色熒光，在紫外燈下發(fā)出強綠色熒光；熒光顯微鏡下，轉化菌株菌體發(fā)出明亮的綠色熒光，細菌形態(tài)呈短棒狀，提示pGFPuv已經(jīng)成功轉入了PAO1菌株中，該轉化菌株可以作為BF空間結構定量化分析研究的模式菌。
2.2 轉化菌株質(zhì)粒提取鑒定及雙酶切鑒定
轉化菌株抽提質(zhì)粒后，電泳結果顯示在2000和3500bp之間有一條約3300bp帶，條帶與質(zhì)粒大小吻合。提取的質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切，電泳顯示在2000和3500bp之間有一條約2500bp帶，在500和1000bp之間有一條約800bp帶，與預期結果吻合，提示pGFPuv已成功轉入PAO1菌株，并以游離質(zhì)粒形式表達。
2.3 CLSM觀(guān)察GFP標記BF模型
6h左右，PAO1已經(jīng)在玻片上黏附聚集，發(fā)出綠色熒光；1d組模型多為綠色熒光，細菌呈微菌落聚集，已具有一定厚度；隨著(zhù)時(shí)間延長(cháng)，BF變厚，3d組及6d組模型肉眼可見(jiàn)一層灰白色膜狀物平鋪于玻片上，鏡下可見(jiàn)大片狀BF，細菌密集，層疊如積云狀，棉絮樣，具備復雜空間結構，細菌之間有許多非綠色的黑色區域，呈管道或泡狀。
2.4 ISA軟件結構定量化分析
對各時(shí)間組模型的平均厚度、AP、ADD及TE進(jìn)行統計，隨著(zhù)培養時(shí)間延長(cháng)，各時(shí)間組PAO1菌株BF的平均厚度不斷增加，增加程度在前3d比較明顯，每個(gè)時(shí)間組之間增加10μm以上，3d后增加速度減慢，3d組與6d組BF的平均厚度僅增加了6μm(表1)；隨著(zhù)培養時(shí)間延長(cháng)，各時(shí)間組模型的AP值呈下降趨勢，由最初的0.98下降到0.92；TE值由最初的0.7上升到4.3，增幅接近6倍；ADD值雖然變化幅度不大，但是呈上升趨勢(表1)。表1 各時(shí)間組PAO1菌株BF的平均厚度、AP、ADD及TE值
3 討論
細菌BF是一個(gè)三維立體空間結構的生態(tài)系，是一個(gè)具有高度結構性、協(xié)調性和功能性的組織群體，BF結構的維持對BF生物學(xué)行為具有重要意義。深入認識BF的結構特點(diǎn)，不能停留在某一平面的形態(tài)描述，還需要對BF的空間結構展開(kāi)定量化分析。由于報道基因中常用的綠色熒光蛋白(GFP)的基因具有基因小、性質(zhì)穩定、對細胞安全等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗運用電轉化方法，成功地將pGFPuv轉入PAO1中，建立體外PAO1菌株BF模型，運用CLSM觀(guān)察以保證細菌BF結構的完整性，連續檢測其在玻片表面定植形成BF的過(guò)程，結合計算機圖像處理分析系統，對BF結構進(jìn)行定量化分析。
BF形成發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，生長(cháng)周期一般分為5個(gè)階段：最初的定植階段、不可逆黏附階段、結構分化階段、發(fā)展成熟階段和解聚再定植階段［4］。本實(shí)驗通過(guò)CLSM連續動(dòng)態(tài)觀(guān)察PAO1菌株BF形成，基本反映了這樣一個(gè)過(guò)程：6h左右PAO1菌株開(kāi)始在玻片表面黏附聚集，1d左右初步形成BF，3d時(shí)BF基本形成，具備三維結構，此后BF逐漸發(fā)展達到一個(gè)平衡，這與文獻報道基本一致［5］。隨著(zhù)培養時(shí)間延長(cháng)，BF厚度逐漸增加，但趨勢漸緩，可能與BF營(yíng)養滲透屏障有關(guān)。
本實(shí)驗還采用ISA軟件獲得了BF空間結構參數的定量化數據，實(shí)現了對BF基礎結構特征的定量化分析。該軟件由美國Montana州立大學(xué)的生物膜工程中心2000年開(kāi)發(fā)，采用自動(dòng)定閾系統［6］，降低了圖片處理中主觀(guān)因素的影響，對BF的二維和三維結構進(jìn)行更多參數的測定和比較。
ISA提供厚度參數顯示，GFP標記的BF模型平均厚度在前3d內增長(cháng)速度明顯快于后3d，提示BF生長(cháng)速度的不均一性。細菌黏附后初期，BF迅速增厚，但隨著(zhù)時(shí)間延長(cháng)，BF厚度增加趨勢減慢，其原因除與營(yíng)養限制有關(guān)外，也可能是BF增加到一定厚度后，為保證底層細菌獲得一定的營(yíng)養物質(zhì)而維持自身結構，對自身發(fā)出密度感應(quorum sensing，QS)信號產(chǎn)生反應，達到平衡狀態(tài)。
本實(shí)驗對BF的觀(guān)察中還發(fā)現BF并非一層單純的致密膜，其內部存在很多黑色相互交通的間隙及孔道，Stoodley等［7］認為這些大、小不一的間隙和通道是BF結構的重要組成部分，其中充滿(mǎn)了胞外多糖和蛋白質(zhì)等營(yíng)養物質(zhì)，與深層BF中的細菌生長(cháng)關(guān)系密切。Wood等［8］在牙菌斑BF也發(fā)現類(lèi)似的間隙和通道貫穿于整個(gè)BF之中，其功能類(lèi)似初級循環(huán)系統，活菌緊緊圍繞在這些孔和通道的周?chē)�，保證營(yíng)養的獲取和排除代謝廢物。此外，BF還可以借這些通道來(lái)感知QS信號。BF這種結構特點(diǎn)決定BF具有一個(gè)能適應多種理化變化的內環(huán)境。
ISA軟件通過(guò)區域孔率(AP)和平均擴散距離(ADD)這兩個(gè)參數，客觀(guān)反映BF結構發(fā)展過(guò)程中間隙孔道及營(yíng)養物質(zhì)供應距離變化。本實(shí)驗發(fā)現隨著(zhù)培養時(shí)間延長(cháng)，BF厚度逐漸增加，AP逐漸減低，ADD逐漸增加，提示BF逐漸發(fā)展，細菌聚集越來(lái)越致密，BF結構中間隙及通道的孔徑和數目減少，相應營(yíng)養物質(zhì)的供應距離增加，細菌物質(zhì)代謝受到一定限制而將逐漸發(fā)展達到一個(gè)相對穩態(tài)。
BF不僅在結構上存在多樣、開(kāi)放、不均一性特點(diǎn)，而且環(huán)境中營(yíng)養物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、信號分子等物質(zhì)在BF各個(gè)層面也呈現不均一性，使得各層BF菌生理活性及耐藥水平也表現出不均一性，最終控制了BF的發(fā)展成熟和整體生物學(xué)行為。這種不均一性可能是BF的“保護效應(insurance effects)”，是細菌生存的重要策略［9］，它使BF無(wú)論受到作用于那個(gè)代謝環(huán)節的抗微生物因子的攻擊，都會(huì )有一些細菌存活“重建家園”。ISA軟件通過(guò)TE參數反映了BF結構發(fā)展過(guò)程中這種不均一性的變化。實(shí)驗結果顯示隨著(zhù)培養時(shí)間延長(cháng)，TE值逐漸增大，說(shuō)明在一定范圍內，伴隨BF發(fā)展成熟，BF的不均一度愈來(lái)愈強，結構越來(lái)越復雜，對外界環(huán)境變化的抵抗能力也加強。
ISA軟件具有較強的分析功能，根據美國Montana州立大學(xué)生物膜工程中心的研究積累發(fā)現，平面參數中以AP、ADD最有實(shí)用價(jià)值，這兩個(gè)參數能直觀(guān)地描述BF的結構特點(diǎn)及營(yíng)養供應情況；而結構參數中以TE最有實(shí)用價(jià)值，可用于不同BF的比較分析。ISA還能提供FD、MDD、AVRL、AHRL、E、H等參數，但是它們與BF發(fā)展的潛在關(guān)系尚不明確，有待于進(jìn)一步驗證［10］。
本實(shí)驗還利用CLSM的三維重建功能對部分模型進(jìn)行了三維重建，得到了PAO1菌株BF的三維立體圖像，圖像反映BF是一個(gè)多樣，開(kāi)放、不均一的結構，與ISA軟件分析結果一致。
需要說(shuō)明，外源基因表達蛋白質(zhì)，需消耗宿主細胞的營(yíng)養物、能量及相關(guān)酶等，是宿主細胞的額外負組，可導致重組質(zhì)粒穩定性降低［11］，而BF中底層細菌營(yíng)養物質(zhì)最差，可能影響了GFP的充分表達。Leff等［12］亦報道，在低營(yíng)養條件下的河水中，GFP質(zhì)�？赡軄G失或不表達。
因此，本實(shí)驗通過(guò)體外建立PAO1菌株BF模型，結合CSLM成功實(shí)現了對PAO1菌株BF的原位、動(dòng)態(tài)觀(guān)察，并利用ISA軟件對獲得的圖片堆進(jìn)行BF空間結構特點(diǎn)的定量分析，比較客觀(guān)地說(shuō)明BF形成過(guò)程中空間結構變化，為進(jìn)一步深入認識細菌BF結構及有效控制細菌BF形成提供新的研究思路和技術(shù)平臺，這對于臨床上控制生物材料相關(guān)性感染具有重大意義。
作者：陳波曼 余加林 劉官信 胡琳燕 李芳 楊華《中國抗生素雜志》
【參考文獻】
［1］ Bauer T T, Torres A, Ferrer R, et al. Biofilm formation in endotracheal tubes. Association between pneumonia and the persistence of pathogens ［J］. Monaldi Arch Chest Dis,2002,57(1):84～87.
［2］ 單志英，徐海津，施興啟，等. 銅綠假單胞菌最佳電轉條件的研究［J］. 遺傳學(xué)報，2004，31(3)：311～316.
［3］ Beyenal H, Donovan C, Lewandowski Z, et al. Threedimensional biofilm structure quantification ［J］. J Microbiol Methods,2004,59(3):395～413.
［4］ O′Toole G, Kaplan H B, Kolter R. Biofilm formation as microbial development ［J］. Annu Rev Microbiol,2000,54:49～79.
［5］ MaiProchnow A, Evans F, DalisaySaludes D, et al. Biofilm development and cell death in the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata ［J］. Appl Environ Microbiol,2004,70(6):3232～3238.
［6］ Yang X, Beyenal H, Harkin G, et al. Evaluation of biofilm image thresholding methods ［J］. Water Res,2001,35(5):1149～1158.
［7］ Stoodley P, Debeer D, Lewandowski Z. Liquid flow in biofilm systems ［J］. Appl Environ Microbiol,1994,60(8):2711～2716.
［8］ Wood S R, Kirkham J, Marsh P D, et al. Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy ［J］. J Dent Res,2000,79(1):21～27.
［9］ Boles B R, Thoendel M, Singh P K. Selfgenerated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities ［J］. Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(47):16630～16635.
［10］ Beyenal H, Lewandowski Z, Harkin G. Quantifying biofilm structure: facts and fiction ［J］. Biofouling,2004,20(1):1～23.
［11］ Kurland C G, Dong H. Bacterial growth inhibition by overproduction of protein ［J］. Mol Microbiol,1996,21(1):1～4.
［12］ Leff L G, Leff A A. Use of green fluorescent protein to monitor survival of genetically engineered bacteria in aquatic environments ［J］. Appl Environ Microbiol,1996,62(9):3486～3488.
