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【摘要】 目的 評價(jià)幾種β內酰胺類(lèi)抗生素對不同的產(chǎn)超廣譜β內酰胺酶(ESBL)肺炎克雷伯菌動(dòng)物肺炎模型的療效。方法選擇臨床分離的2株對實(shí)驗用抗生素敏感的產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌建立小鼠肺炎模型。根據細菌分為GX6998和Tian 29兩組，于感染后6h給藥。對照組腹腔注射生理鹽水0.5ml；治療組分別給予頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦。連續治療72h后，根據細菌計數結果評價(jià)療效。結果 體外藥敏試驗表明Tian 29對4種抗生素的MIC值均大于GX6998，但仍在敏感范圍內。4種抗生素治療后，各組病死率均顯著(zhù)減低。GX6998組中4種抗生素均可顯著(zhù)降低肺組織勻漿的細菌計數(P<0.01)。Tian 29組中頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶可以顯著(zhù)降低肺組織勻漿的細菌計數(P<0.05)；頭孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦也可使組織勻漿的細菌計數減少，但與對照組比較差異無(wú)顯著(zhù)性(P>0.05)。比較同一種抗生素對2株細菌的清除作用發(fā)現，4種抗生素對GX6998的清除作用均強于Tian 29(P<0.01)。結論 體外敏感的廣譜β內酰胺類(lèi)抗生素和β內酰胺酶抑制劑復合制劑治療產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌感染均可顯著(zhù)降低動(dòng)物模型的死亡率，減少肺組織勻漿細菌計數。但如果細菌對抗生素的MIC升高，將會(huì )影響治療效果。
【關(guān)鍵詞】 超廣譜β內酰胺酶； β內酰胺類(lèi)抗生素； 肺炎克雷伯菌； 藥效學(xué)
ABSTRACT Objective To evaluate the efficacy of several βlactams against ESBL producing Klebsiella pneumoniae pneumonia in a mouse model of peneumonia. Methods Two clinical Klebsiella pneumoniae strains susceptible to the experimental antimicrobial agents, Klebsiella pneumoniae GX6998 and Tian 29, were divided into two groups for mouse pneumonia infection respectively. After sixhour infection, mice were intraperitoneally injected with 0.5ml 0.9% NaCl for control; mice were intraperitoneally injected with ceftazidime, cefepime, cefoprazone plus sulbactam and piperacillin plus tazobactam respectively for trial. Seventytwo hours later, therapy efficacies were evaluated with bacterial counts. Results All the trial groups had significantly lower mortality than control groups (P<0.05). Compared with the control groups, in GX6998infected groups, the bacterial amounts with all the testing agents were significantly decreased (P<0.01); in Tian 29infected group, the bacterial amounts with cefoprazone plus sulbactam and ceftazidime were significantly decreased (P<0.05); in cefepime and piperacillin plus tazobactam groups, bacterial amounts were reduced without significant difference with that of the control group (P>0.05). Conclusion The combinations of broadspectrum βlactams and βlactamases inhibitor could reduce the mortality and bacterial amountsin mouse pneumonia model which were susceptible to ESBLsproducing Klebsiella pneumonia strains. However, the clinical efficacy would be reduced when the MIC increased.
KEY WORDS Extended spectrum βlactamases; βLactams Klebsiella pneumonia; Pharmacodynamics
肺炎克雷伯菌是院內下呼吸道感染的主要致病菌。我國院內感染的肺炎克雷伯菌43%為產(chǎn)超廣譜β內酰胺酶(ESBL)菌株［1］。感染產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌患者的預后明顯較感染不產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌患者差［2］，能否使用廣譜β內酰胺類(lèi)抗生素治療此類(lèi)感染一直存在爭議。本研究通過(guò)小鼠肺炎模型評價(jià)幾種臨床常用的廣譜β內酰胺類(lèi)抗生素和酶抑制劑復合制劑對產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌動(dòng)物肺炎的療效。
1 材料與方法
1.1 材料
(1)觀(guān)察藥品 頭孢他啶(Glaxo Smithkline公司，批號C076348，純度89.4%)；頭孢吡肟(BristalMyers Squibb公司，批號0505793，純度88.6%)；頭孢哌酮/舒巴坦(Pfizer公司，批號45839147，純度96.6%)；哌拉西林/三唑巴坦(Wyeth公司，批號A56167，純度88.6%)。
1.2 實(shí)驗菌株
使用臨床分離的產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌GX6998和Tian 29建立肺炎模型，菌株來(lái)自國家食品藥品監督管理局細菌耐藥性監測中心。ESBLs表型確證試驗按CLSI/NCCLS(2002年)標準紙片擴散法操作。
1.3 實(shí)驗動(dòng)物
雄性昆明種小白鼠，體重(25±2)g，購自中國醫學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所。
1.4 產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌最小抑菌濃度(MIC)測定
細菌MIC的測定采用CLSI/NCCLS(2002年)推薦的微量肉湯稀釋法，使用大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603作為質(zhì)控菌［3］。
1.5 建立肺炎模型
將菌株密集劃線(xiàn)于MH培養基上，
實(shí)驗小鼠稱(chēng)重后腹腔注射10%水合氯醛(0.4ml/g)麻醉，自頸部正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離直至暴露氣管。用1ml注射器將30μl菌懸液經(jīng)氣管緩慢注入后將小鼠直立搖晃3min，使細菌盡量均勻分布于兩肺。
1.6 動(dòng)物分組及給藥方案
將小鼠隨機分為兩組，分別接種肺炎克雷伯菌GX6998和Tian 29。兩組內再根據治療措施不同分為對照組和頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦4個(gè)抗生素組。治療開(kāi)始于接種細菌后6h，對照組每8h腹腔注射生理鹽水0.5ml；4個(gè)抗生素組分別每8h腹腔注射頭孢哌酮/舒巴坦200mg/kg、頭孢他啶200mg/kg、頭孢吡肟200mg/kg，每6h腹腔注射哌拉西林/三唑巴坦120mg/kg，以上方案連續應用3d后統計各組的病死率。之前的藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗表明，此給藥方案可以保證4種抗生素的血清藥物濃度大于肺炎克雷伯菌GX6998 MIC值的時(shí)間超過(guò)給藥間隔的40%。
1.7 細菌計數測定
各組分別于治療前及治療后24、48和72h(最后一次給藥后4h)各時(shí)間點(diǎn)將小鼠處死后充分放血，取雙肺，冰生理鹽水沖洗3次，置于玻璃勻漿器中加入2ml生理鹽水研磨15min，制成肺組織勻漿。10倍倍比稀釋肺組織勻漿，依次取各濃度100μl接種于MH瓊脂培養基上，
1.8 統計學(xué)分析
采用SPSS11.5統計軟件包進(jìn)行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用方差分析，組間兩兩比較應用q檢驗，計數資料采用卡方檢驗，P<0.05認為有顯著(zhù)性差異。
2 結果
2.1 MIC測定結果
Tian 29對4種抗生素的MIC值均大于GX6998，但仍在敏感范圍內(表1)。
2.2 病死率比較
兩組中，頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟以 表1 2株細菌對4種抗生素的MIC值(mg/L)以頭孢哌酮的標準判讀此結果。
及哌拉西林/三唑巴坦治療后與對照組比較病死率顯著(zhù)降低。各抗生素組間病死率比較無(wú)顯著(zhù)差異(表2)。
2.3 細菌計數結果
(1)4種抗生素對GX6998感染的療效比較 治療72h后，4種抗生素都可以顯著(zhù)降低肺組織的細菌量(P<0.01)；治療前后細菌計數的差值與對照組比較均有顯著(zhù)性差異(P<0.01)；各抗生素組間比較無(wú)顯著(zhù)性差異(表3)。表2 4種抗生素治療2株細菌感染的病死率比較表3 4種抗生素對GX6998殺菌作用比較 *：與治療前比較P<0.01； **：與對照組比較P<0.01。
(2)4種抗生素對Tian 29感染的療效比較 治療72h后，頭孢哌酮/舒巴坦和頭孢他啶可顯著(zhù)降低肺組織的細菌量，治療前、后細菌計數的差值與對照組比較有顯著(zhù)性差異(P<0.05)；頭孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦治療72h后細菌計數有所減少，但和治療前比較無(wú)顯著(zhù)性差異，治療前、后細菌計數的差值與對照組比較也無(wú)顯著(zhù)性差異(表4)。
(3)同一抗生素對2株細菌感染的療效比較 比較兩組中每一種抗生素治療前后肺組織細菌計數的差值發(fā)現，4種抗生素對GX6998的清除作用均強于Tian 29(表5)。 表4 比較4種抗生素對Tian 29殺菌作用表5 比較4種抗生素對2株菌的殺菌作用
3 討論
本研究通過(guò)觀(guān)察4種臨床常用的廣譜β內酰胺類(lèi)抗生素治療產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌導致的小鼠肺炎，發(fā)現4種抗生素均對MIC值較低的細菌GX6998清除作用較好；對細菌Tian 29清除作用較差，即使Tian 29對這些抗生素也敏感，提示即使廣譜β內酰胺類(lèi)抗生素對產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌敏感，隨著(zhù)MIC值的升高其治療效果也會(huì )逐漸減弱。
廣譜β內酰胺類(lèi)抗生素因為對產(chǎn)β內酰胺酶和廣譜β內酰胺酶的革蘭陰性菌治療效果良好，一直被廣泛應用于臨床。研究發(fā)現，廣譜β內酰胺類(lèi)抗生素治療敏感的產(chǎn)ESBLs細菌感染往往不能達到預期的效果，其治愈率和生存率明顯低于碳青霉烯類(lèi)、頭霉素類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物，所以不建議用于治療產(chǎn)ESBLs細菌導致的感染［4］。
目前認為β內酰胺抗生素治療產(chǎn)ESBLs細菌感染失敗的主要原因之一是接種量效應。腸桿菌科細菌對所有的β內酰胺類(lèi)抗生素均有不同程度的接種量效應，其中頭孢吡肟最明顯［5］。但是接種量效應并不能說(shuō)明使用β內酰胺類(lèi)抗生素治療一定無(wú)效。Maglio等［6］在實(shí)驗中選擇了多株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌建立動(dòng)物感染模型，雖然體外實(shí)驗也表現明顯的接種量效應，但體內實(shí)驗發(fā)現感染部位105和107CFU/ml細菌量對于頭孢吡肟的治療效果并沒(méi)有影響。ThanvinEliopoulos等用哌拉西林/三唑巴坦和頭孢吡肟治療產(chǎn)ESBL的肺炎克雷伯菌大鼠腹腔膿腫模型，也得到相同的結果［7］。兩項研究均表明，血清藥物濃度大于藥物對細菌的MIC的時(shí)間(% T>MIC)是判斷β內酰胺類(lèi)抗生素抗感染療效的有效指標。
本實(shí)驗選擇了2株對4種抗生素都敏感的產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌建立肺炎模型，結果顯示，在GX6998組中4種抗生素都可以明顯減少肺組織的細菌計數；在Tian 29組中，頭孢哌酮/舒巴坦和頭孢他啶也可以顯著(zhù)減少肺組織的細菌計數；頭孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦雖然可以使細菌計數有一定的減少，但和對照組比較沒(méi)有顯著(zhù)性差異；4種抗生素在GX6998組中的細菌清除的效果均好于Tian 29組。這是由于β內酰胺類(lèi)抗生素屬時(shí)間依賴(lài)性抗生素，要達到理想的治療效果，要求采取的給藥方式能夠使% T>MIC不少于40%～50%給藥間隔時(shí)間［8］。本次實(shí)驗同時(shí)進(jìn)行的藥物濃度檢測結果，由于4種抗生素對Tian 29的MIC升高，使此組中4種抗生素的% T>MIC小于40%，甚至不到30%。
我們的實(shí)驗表明使用體外敏感的廣譜β內酰胺類(lèi)抗生素和β內酰胺酶抑制劑復合制劑治療產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌感染，可以明顯降低動(dòng)物模型的死亡率，可以顯著(zhù)減少肺組織勻漿活菌計數。但如果細菌對抗生素的MIC升高，即使仍在敏感范圍內，仍將影響治療效果，甚至導致治療失敗。
分析以往的臨床研究發(fā)現，隨著(zhù)MIC值降低，敏感的廣譜β內酰胺類(lèi)抗生素治療產(chǎn)ESBL細菌感染的失敗率逐漸減低［4，9］。目前，隨著(zhù)碳青霉烯類(lèi)、頭霉素類(lèi)抗生素應用增多，產(chǎn)ESBL細菌對它們的耐藥情況逐漸加重。產(chǎn)ESBL細菌常攜帶多種耐藥基因，同時(shí)對氟喹諾酮類(lèi)和/或氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物耐藥［10］，這樣大大限制了臨床用藥的選擇，給治療帶來(lái)困難。所以我們認為不應該完全限制廣譜β內酰胺類(lèi)抗生素應用于此類(lèi)感染，而是根據廣譜β內酰胺類(lèi)抗生素的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)和對產(chǎn)ESBL腸桿菌科細菌的MIC選擇用藥。這就需要更多的大規模的臨床研究來(lái)評價(jià)此類(lèi)抗生素治療產(chǎn)ESBL細菌感染的臨床療效。
作者：裴迎華 張杰 馬越 李景云 《中國抗生素雜志》
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