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【摘要】 目的 了解嗜麥芽寡養單胞菌的臨床株H407和A26在抗菌藥物誘導下耐藥性和SmeDEF外排泵表達的變化。方法 比較有或無(wú)環(huán)丙沙星誘導時(shí)嗜麥芽寡養單胞菌H407和A26的MIC和EOP值，對在亞抑菌濃度環(huán)丙沙星中培育后的菌株smeD基因進(jìn)行RT-PCR擴增，監測表達水平。結果 對抗生素敏感的H407和A26泵抑制呈陽(yáng)性或陰性反應。2株菌經(jīng)環(huán)丙沙星過(guò)夜孵育后測得的對氯霉素和環(huán)丙沙星MIC值比正常非誘導時(shí)的MIC值高1～3個(gè)稀釋度；加泵抑制劑CCCP后，2個(gè)誘導株的MIC值均有明顯下降。H407和A26經(jīng)環(huán)丙沙星誘導后氯霉素的EOP分別有4.8和近4倍的增長(cháng)。2株菌在抗菌藥物過(guò)夜和指數期添加生長(cháng)時(shí)smeD的mRNA明顯高于無(wú)抗菌藥物培養株。結論 2株嗜麥芽寡養單胞菌臨床株在環(huán)丙沙星誘導下對部分抗菌藥物的耐藥性提高，與SmeDEF泵的誘導表達增加有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 嗜麥芽寡養單胞菌； 外排泵； 耐藥性； 誘導
ABSTRACT Objective To investigate changes of antibiotic resistance of the clinical isolates of S.maltophilia, and the repression level of efflux pump SmeDEF by the induction of antibiotics. Methods To examine the resistance profile of the clinical strains by agar dilution and the efficiency of plate (EOP) to antimicrobes, and their reactions to pump inhibitor CCCP, and to investigate the mRNA level of smeD by RT-PCR, in the presence or not of ciprofloxacin. Results The antibiotic-sensitive strains H407 and A26 were positive and negative to pump inhibitor respectively. MICs of ciprofloxacin and chloramphenicol induced by ciprofloxacin with sub-inhibition level were higher by 1～3 dilutions than those without induction. The incre-ases were inhibited by CCCP. After induction by ciprofloxacin, the EOP to chloramphenicol in H407 and A26 increased by 4.8 and nearly 4 times respectively, and the level of mRNA of smeD in the 2 antimicrobe-induced strains rose as well. Conclusion The resistance to several antimicrobes in the two isolates of S.maltophilia could be induced by ciprofloxacin. The possible antibiotic resistance mechanisms seemed likely by the mvolvement of the increased transcription level of smeDEF.
KEY WORDS Stenotrophomonas maltophilia; Antibiotic resistance; Efflux pump; Induction
嗜麥芽寡養單胞菌是機會(huì )致病菌，近10年來(lái)該菌所致的感染不斷上升，已成為醫院內感染的重要的致病菌之一，可引起身體多個(gè)部位的炎癥及敗血癥，其中在下呼吸道感染的分離率高。嗜麥芽寡養單胞菌耐藥性強，對臨床使用的多數抗生素都具有耐藥性［1，2］， 對部分抗生素甚至高度耐藥。嗜麥芽寡養單胞菌內源性和獲得性多重耐藥機制可能與存在多重外排泵有關(guān)，已發(fā)現的外排泵SmeDEF對多種毒性物質(zhì)和包括氟喹諾酮類(lèi)的多種抗生素有外排作用［3］。研究顯示SmeDEF的表達水平與該菌多重耐藥程度有關(guān)。了解藥物外排泵及其調控機制對于該菌多重耐藥本質(zhì)的認識和藥物作用靶位的研究均有重要意義。目前對嗜麥芽寡養單胞菌外排泵SmeDEF表達調控機制的研究較少，發(fā)現SmeT蛋白對SmeDEF轉錄有阻遏作用。已有研究發(fā)現多藥外排泵如大腸埃希菌AcrAB泵的表達能被膽鹽和某些抗菌藥物所激發(fā)，可能與感染時(shí)大腸埃希菌耐藥表型的誘導有關(guān)［4，5］。外排系統調控機制復雜，是否在嗜麥芽寡養單胞菌中也有這樣的誘導機制？本研究對嗜麥芽寡養單胞菌臨床株在抗菌藥物誘導下的表型和藥物外排泵SmeDEF表達進(jìn)行分析，探討這些變化在耐藥中所起作用。
1 材料與方法
1.1 材料
(1)菌株來(lái)源 嗜麥芽寡養單胞菌臨床株H407和A26分別來(lái)自感染者的痰與氣管吸出物。銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸埃希菌ATCC25922作藥敏實(shí)驗質(zhì)量控制。
(2)抗菌藥物和主要化學(xué)試劑 抗菌藥物為氯霉素和環(huán)丙沙星；標準品購自北京天壇生物制品研究所。泵抑制劑CCCP為Sigma公司產(chǎn)品。培養基為LB肉湯、MH和LB瓊脂，溴化乙啶(EB)為Sigma公司產(chǎn)品。SV Total RNA Isolation System、RT-PCR系統(Cat.#1260)和瓊脂糖購自Promega公司產(chǎn)品。分子量標準DL-2000購自TaKaRa公司。
1.2 方法
(1)抗菌藥物誘導和非誘導時(shí)的MIC值 取LB平皿上過(guò)夜生長(cháng)的單菌落，分別接種于含環(huán)丙沙星(濃度為1/3MIC)的LB肉湯，孵育過(guò)夜；離心沉淀后重溶，多點(diǎn)接種于含和不含25μg/ml CCCP的環(huán)丙沙星和氯霉素的倍比稀釋MHA平皿上，濃度105CFU/spot，
(2)抗菌藥物誘導的菌株耐藥性—平皿效率實(shí)驗(EOP) H407和A26同時(shí)進(jìn)行以下兩組實(shí)驗。一組取LB平皿上過(guò)夜孵育的菌落，105CFU/ml 2.5μl涂布于含氯霉素(濃度為0.8MIC)的MHA平皿和空白對照平皿。另一組在含環(huán)丙沙星(濃度為1/3MIC)的LB平皿過(guò)夜孵育的菌落，稀釋后同樣涂布于含氯霉素的平皿和空白對照平皿，
(3)檢測誘導前后smeD表達(RT-PCR) 菌株H407和A26同時(shí)進(jìn)行以下三組實(shí)驗。一組在LB肉湯中，
以嗜麥芽寡養單胞菌β-內酰胺酶L2的基因blal2的258bp片段(引物：上游B1，下游B2)作為參照進(jìn)行RT-PCR，RNA約0.5μg。
2 結果
2.1 實(shí)驗菌株的耐藥特性
H407和A26對抗菌藥物耐藥表型和一般特性列表2。其中H407對諾氟沙星、環(huán)丙沙星和氧氟沙星敏感，在使用泵抑制劑后MIC無(wú)變化；A26對以上幾種藥物也敏感，但在加泵抑制劑CCCP后對氯霉素的MIC值降至原值的1/4。藥物敏感性變化見(jiàn)表3。
2.2 抗菌藥物誘導和非誘導時(shí)的MIC值
H407和A26與環(huán)丙沙星過(guò)夜孵育后對氯霉素和環(huán)丙沙星MIC比正常非誘導時(shí)MIC高1～3個(gè)稀釋度，其中A26經(jīng)誘導后對環(huán)丙沙星和氯霉素的MIC分別增長(cháng)3和2個(gè)稀釋度，大于H407的2和1個(gè)稀釋度。加泵抑制劑CCCP后，H407和A26誘導株的MIC均有明顯下降，除A26誘導株被CCCP抑制后的氯霉表1 擴增反應使用引物表2 實(shí)驗菌株的一般特性表3 H407和A26對環(huán)丙沙星誘導和非誘導時(shí)的素MIC降至無(wú)誘導時(shí)被抑制的水平(8μg/ml)，H407和A26誘導株加CCCP后的其余MIC均比無(wú)誘導時(shí)加或不加泵抑制劑的MIC值高，提示經(jīng)環(huán)丙沙星誘導的菌株在抑制外排作用后對環(huán)丙沙星的耐藥性明顯下降，但未恢復至誘導前被抑制的敏感水平，甚至未達到無(wú)誘導時(shí)的敏感性。
2.3 抗菌藥物誘導菌株的EOP結果
EOP是更為準確的測量不同菌群中耐藥水平的方法。H407誘導前氯霉素的EOP值為0.075，環(huán)丙沙星誘導后的氯霉素EOP為0.28，顯示有近4倍的增長(cháng)。A26無(wú)環(huán)丙沙星誘導時(shí)氯霉素的EOP值為0.12，誘導后的EOP為0.57，顯示耐藥性增長(cháng)了4.8倍(表3)。
2.4 抗菌藥物誘導和非誘導株smeD的RT-PCR結果
H407和A26在亞抑菌濃度環(huán)丙沙星誘導后，smeD的mRNA水平增高，在3個(gè)RNA濃度下均可見(jiàn)添加抗菌藥物的兩組比對照組的RT-PCR條帶亮度高，抗菌藥物過(guò)夜組與指數期添加組的亮度無(wú)明顯不同。作為對照的blal2 mRNA水平誘導前后無(wú)明顯改變。圖1、2為A26菌株smeD和blal2的RT-PCR電泳結果。
3 討論
外排泵(efflux pump)作為一種抗菌藥物耐藥的機制，首先報道于20世紀80年代初。之后，在許多細 A、D、G：指數期添加組； B、E、H：抗菌藥物過(guò)夜組；菌中發(fā)現外排泵介導的多重抗菌藥物耐藥，例如NorA、AcrAB、RobA、MexAB以及Bmr等［8～11］。有證據表明嗜麥芽寡養單胞菌的多重外排泵是其固有和獲得性多重耐藥的最重要原因。SmeDEF外排泵是嗜麥芽寡養單胞菌與耐藥有關(guān)的重要的外排泵，SmeDEF的外排底物有喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素、氯霉素、大環(huán)內酯類(lèi)等結構不相關(guān)的抗菌藥物。Li等［12］實(shí)驗中野生株ULA511的smeDEF低表達，野生株SmeDEF的耐藥譜與高表達smeDEF的MDR突變株相同。Aloson等［13］發(fā)現僅部分嗜麥芽寡養單胞菌臨床株的smeDEF有轉錄活性，存在活性SmeF。一般認為一些多重外排泵在細菌的正常生長(cháng)代謝中起作用［14］，本研究室也證實(shí)smeDEF基因廣泛存在于嗜麥芽寡養單胞菌臨床株中，而且該基因的轉錄水平與菌株的耐藥程度有關(guān)［7］。
已知決定外排泵活性大小的最常見(jiàn)因素是調控其表達的一些因子的變化，這些調控因子或作用對象的改變對耐藥性變化的影響不完全一致。包括革蘭陰性菌的多種致病菌中，多藥外排系統的結構基因常在附近調控基因編碼蛋白的嚴謹降調控下［4，15］，外排泵的高表達常常由于這些調控基因的突變所致。但有些外排泵的調控機制更為復雜，如調節大腸埃希菌Mar耐藥的情況。與泵有關(guān)的耐藥機制中，可因耐藥調控有關(guān)的一些編碼/非編碼序列的改變［16，17］，或調控因子活性變化而使外排泵轉錄或翻譯升高，而增加菌株的耐藥性。
(1)SmeT的實(shí)驗研究 SmeT是SmeDEF轉錄的阻遏子，SmeT蛋白屬于TetR和AcrR轉錄抑制子家族。SmeT的編碼基因660bp，位于smeD上游223bp，SmeT與SmeDEF反方向轉錄。smeDEF和smeT分別有單啟動(dòng)子PsmeDEF和PsmeT，兩個(gè)基因啟動(dòng)子可能交互影響。Sanchez等［3］的研究中，SmeT在敏感菌株D457中低表達，而在耐藥株D457R的表達水平高，SmeT可能同時(shí)降調控SmeT自身轉錄。SmeT在敏感菌中濃度有限，人為地增加其表達可進(jìn)一步提高菌株敏感性。這可能是野生SmeT對SmeDEF外排泵本底表達的調控，使之在生理條件下起作用。
(2)誘導機制的研究 嗜麥芽寡養單胞菌外排泵SmeDEF的表達亦受到生長(cháng)周期的調控，SmeDEF和SmeT的表達也可能以不同方式對環(huán)境和生理信號起反應［13］。除了生長(cháng)相調控，嗜麥芽寡養單胞菌有否類(lèi)似一些外排系統由水楊酸類(lèi)似物等天然活化信號分子或抗菌藥物底物激發(fā)，表達增加的機制？此前還未有嗜麥芽寡養單胞菌外排泵可被其底物誘導的報道。
通過(guò)檢測嗜麥芽寡養單胞菌H407和A26(泵抑制陽(yáng)性和陰性的敏感菌株)的MIC和EOP值，觀(guān)察到在亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星中生長(cháng)后對抗菌藥物的耐藥性均有所提高，而且這種增加的耐藥性均能在泵抑制劑作用下降低，但對泵抑制劑不敏感的H407未恢復至誘導前被抑制的敏感水平，甚至未達到無(wú)誘導時(shí)菌株的敏感性。所以，外排作用在這樣的耐藥水平增加中很重要，而且還有其它機制參與誘導后的耐藥性增加。對mRNA水平監測發(fā)現環(huán)丙沙星誘導后SmeDEF泵的表達亦有顯著(zhù)增高，而在指數期抗菌藥物作用1h已有明顯的提高，說(shuō)明誘導作用主要發(fā)生在轉錄調控方面，關(guān)于其它泵的誘導實(shí)驗證實(shí)了這一機制［6］。這也可能解釋在有的病例中，如環(huán)丙沙星等抗菌藥物治療過(guò)程中嗜麥芽寡養單胞菌耐藥性增加的情況，以及在臨床中發(fā)現的治療與體外藥敏實(shí)驗結果不符的部分病例。
對誘導物和阻遏蛋白的作用，及與基因調控的研究已有很長(cháng)時(shí)間，報道有些外排泵的底物如膽鹽及多種藥物有誘導外排泵表達的作用［5，18］。研究顯示誘導作用可通過(guò)底物與外排泵的負調控子相互作用而實(shí)現［6，10］，或某些誘導作用通過(guò)與正調控子的作用。金葡菌QacA多重外排泵的負調控子QacR［19］，以及四環(huán)素外排泵TetA的負調控子TetR和大腸埃希菌多重外排泵EmrAB的EmrR，均直接參與誘導作用［10，11］。根據同族蛋白的變化，推測嗜麥芽寡養單胞菌的誘導過(guò)程：抗菌藥物進(jìn)入細菌體內后，直接或通過(guò)中間代謝產(chǎn)物，與阻遏蛋白SmeT結合，不是建立或斷裂個(gè)體之間的鍵，而是改變蛋白形狀，降低其與操作區的親和力。兩分子的誘導物結合于四聚體足以解除其抑制作用。誘導物的結合改變了帽相對于核心的方向，使得一個(gè)二聚體內的兩個(gè)帽不再能同時(shí)結合DNA，消除了多聚的優(yōu)點(diǎn)，降低了對操作區的親和力，從而改變了阻遏蛋白在DNA鏈上的分布［20］。除了環(huán)丙沙星能誘導嗜麥芽寡養單胞菌耐藥性的提高，應該還有其它一些外排泵底物或類(lèi)似物可以作為誘導劑調節泵的表達水平。
(3)其他可能的機制 根據已知與泵有關(guān)的耐藥機制的結論和本研究的結果，嗜麥芽寡養單胞菌臨床株有關(guān)SmeDEF的耐藥性除有誘導機制，還可能有非編碼基因序列的變化引起結構基因smeD轉錄或翻譯增強，或可能通過(guò)阻遏蛋白SmeT作用發(fā)揮所需的序列變化影響。本室前期研究發(fā)現耐藥菌SmeT阻遏蛋白序列出現Asp218Glu氨基酸替換，以及125、136、138和148位氨基酸多個(gè)位點(diǎn)的替換。Sanchez等實(shí)驗室檢測序列分析證實(shí)SmeT的leu166Gln氨基酸突變導致了嗜麥芽寡養單胞菌D457R的蛋白活性下降�？赡転橛绊懙鞍椎姆�定性，SmeT抑制活性降低或失活。不同耐藥機制單獨或可能聯(lián)合起作用，增加臨床菌株與多重外排有關(guān)的耐藥性。該菌對喹諾酮等抗菌藥物的耐藥性可能還有除了泵的其他機制，如還未得到證實(shí)的可能的靶酶突變［20］。
本研究?jì)H就SmeDEF外排泵的底物誘導作用作一初步探討，這些發(fā)現在國內、外尚屬首次。嗜麥芽寡養單胞菌SmeDEF外排泵的調控機制很復雜，可能有眾多的順式和反式因子對表達起作用。有關(guān)嗜麥芽寡養單胞菌臨床株SmeDEF外排泵的表達調控及與耐藥性產(chǎn)生的具體機制還有待今后進(jìn)一步明確。
作者：孫二琳 宋詩(shī)鐸 祁偉 王玉寶《中國抗生素雜志》
【參考文獻】
［1］ Valdezate S, Vindel A, Loza E, et al. Antimicrobial susceptibilities of unique Stenotrophomonas maltophilia clinical strains ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2001,45(5):1581～1584.
［2］ 孫二琳， 宋詩(shī)鐸. 泵抑制劑對嗜麥芽寡養單胞菌臨床株氟喹諾酮類(lèi)敏感性的影響［J］. 中國抗生素雜志，2003，28(12)：756～760.
［3］ Sanchez P, Alonso A, Martinez J L. Cloning and characterization of smeT, a repressor of the Stenotrophomonas maltophilia multidrug efflux pump smeDEF ［J］. Antimicrob Agent Chemother,2002,46(11):3386～3393.
［4］ Ma D, Alberti M, Lynch C, et al. The local repressor AcrR plays a modulating role in the regulation of acrAB genes of Escherichia coli by global stress signals ［J］. Mol Microbiol,1996,19(1):101～112.
［5］ Okusu H, Ma D, Nikaido H. AcrAB dfflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants ［J］. J Bacteriol,1996,178(1):306～308.
［6］ Rouquette C, Harmon J B, Shafer W M. Induction of the mtrCDE-encoded efflux pump system of Neisseria gonorrhoeae requires MtrA, an ArC-like protein ［J］. Mol Microbiol,1999,33(3):651～658.
［7］ 孫二琳， 宋詩(shī)鐸. 嗜麥芽寡養單胞菌臨床株的多重耐藥外排泵的研究［J］. 中華微生物和免疫學(xué)雜志，2004，24(9)：743～747.
［8］ Poole K, Teyro K, Zhao Q, et al. Expression of multidrug resistance operon mexA-mexB-oprM in Pseudomonas aeruginosa mexR encodes a regulator of operon expression ［J］. Antimicrob Agent Chemother,1996,40(9):2021～2028.
［9］ Zagurskaya H, Nikaido H. Mutidrug resistance mechanisms: drug efflux across two membranes ［J］. Mol Microbiol,2000,37(2):219～222.
［10］ Smith L D, Bertrand K P. Mutations in the Tn 10 tet repressor that interfere with induction. Location of the tetracycline-binding domain ［J］. J Mol Biol,1988,203(4):949～959.
［11］ Peterson M L, Hovde L B, Wright D H, et al. Fluoroquinolone resistance in Bacteroides fragilis following sparfloxacin exposure ［J］. Antimicrob Agents Chemo-ther,1999,43(9):2251～2255.
［12］ Zhang L, Li X Z, Poole K. SmeDEF multidrug efflux pump contributes to intrinsic multidrug resistance in Stenotrophomonas maltophilia ［J］. Antimicrob Agent Chemother,2001,45(12):3497～3503.
［13］ Alonso A, Martinez J L. Cloning and characterization of smeDEF, a novel multidrug efflux pump from Stenotrophomonas maltophilia ［J］. Antimicrob Agent Chemother,2000,4(4):3079～3086.
［14］ Aloson A, Jose M L. Expression of multidrug efflux pump SmeDEF by clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia ［J］. Antimicrob Agent Chemother,2001,45(6):1879～1881.
［15］ Paulsen I T, Sliwinske M K, Saier M J. Microbial genome analyses: global comparisons of transport capabilities based on phylogenids, bioenergetics and substrate specificities ［J］. J Mol Biol,1998,277(3):573～592.
［16］ Pool K, Teyro K, Zhao Q, et al. Expression of multidrug resistance operon mexA-mexB-oprM in Pseudomonas aeruginosa: mexR encodes a regulator of operon expression ［J］. Antimicrob Agent Chemother,1996,40(9):2021～2028.
［17］ Benjamin Lewin. Genes VII. Edition 7th ［M］. UK: Oxford University Press,2000:923～1254.
［18］ Kieboom J, Dennis J J, Zylstra G J, et al. Active efflux of organic solvents by Pseudomonas putida S12 is induced by solvents ［J］. J Bacteriol,1998,180(24):6769～6772.
［19］ Grkovic S, Brown M H, Roberts N J, et al. QacR is a repressor protein that regulates expression of the Staphylococcus aureus multidrug efflux pump QacA ［J］. J Biol Chem,1998,273(29):18665～18673.
［20］ Valdezate S, Vindel A, Echeita A, et al. Topoisomerase II and IV quinolone resistance- determining regions in Stenotrophomonas maltophilia clinical isolates with different levels of quinolone susceptibility ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2002,46(3):665～671.
