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【摘要】 目的 了解臨床分離的54株大腸埃希菌對氨基糖類(lèi)苷類(lèi)抗生素的耐藥譜及產(chǎn)ESBLs情況，分析氨基糖苷類(lèi)修飾酶AAC(3)-II的檢出率及該酶的一些特征。方法采用MIC法測定臨床分離的54株大腸埃希菌對7種氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥譜，用NCCLS推薦的酶抑制劑增強紙片擴散法檢測產(chǎn)ESBLs菌株，并通過(guò)聚合酶鏈反應、克隆測序和測定重組菌耐藥譜對aac(3)-II基因進(jìn)行研究。結果 54株大腸埃希菌對阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、鏈霉素、大觀(guān)霉素和奈替米星的耐藥率分別為14.8%、77.8%、59.3%、66.7%、68.5%、61.1%、22.2%；共檢測出產(chǎn)ESBLs菌株34株，占63.0%；aac(3)-II基因在54株大腸埃希菌中檢出率為88.5%；質(zhì)粒轉化菌產(chǎn)ESBLs且同時(shí)檢出aac(3)-II基因。重組菌BL21(DE3)/pET26：：aac(3)-II對慶大霉素和卡那霉素有耐藥性，對其余5種氨基糖苷類(lèi)抗生素沒(méi)有表現出耐藥性。結論大腸埃希菌對慶大霉素的耐藥率最高，對阿米卡星的耐藥率最低；耐氨基糖苷類(lèi)抗生素的大腸埃希菌與其產(chǎn)ESBLs有相關(guān)性；重組菌BL21(DE3)/pET26：：aac(3)-II僅對慶大霉素和卡那霉素產(chǎn)生耐藥。
【關(guān)鍵詞】 大腸埃希菌； 氨基糖苷類(lèi)抗生素； 修飾酶； 超廣譜β內酰胺酶； 耐藥性
Research on aminoglycoside resistance profiles and producing ESBLs
ABSTRACT Objective To investigate the aminoglycoside resistance profiles and producing ESBLs of clinical Escherichia coli strains and analyze the characteristic of AAC(3)-II. Methods MIC tests of 7 aminoglycosides and ESBLs confirmation tests were performed 54 strains of E.coli aac(3)-II gene was amplified by PCR and cloned into pET26b, then and sequenced. Activity of AAC(3)-II was tested by MIC method. Results The resistant rates of 54 strains of E.coli to amikacin, gentamicin, kanamycin, tobramycin, streptomycin, spectinomycin, netilmicin were 14.8%, 77.8%, 59.3%, 66.7%, 68.5%, 61.1%, 22.2% and 63.0% (34/54) of strains were found producing ESBLs. The positive rate of aac(3)-II gene was 88.5% (45/54). The aac(3)-II gene resistance to gentamicin and kanamycin, but not other 5 aminoglycosides. Conclusions Fifty-four strains of E.coli had the highest resistant rate to gentamicin while had the lowest resistant rate to amikacin. ESBLs-producing strains were mostly in aminoglycoside -resistance E.coli. The aac(3)-II gene only mediates resistance to gentamicin and kanamycin.
KEY WORDS Escherichia coli; Aminoglycosides; Modifying enzymes; Extended-spectrum beta-lactamases; Antibiotic resistance
大腸埃希菌(E.coli)是條件致病菌，2002年全國細菌耐藥性監測網(wǎng)對所屬57家三級甲等醫院的調查發(fā)現，其臨床分離率列第一位(14.2%)［1］。目前國內對大腸埃希菌的多重耐藥性已引起很大的重視，對β-內酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)抗生素(aminoglycosides)的耐藥機制有較多的研究，但兩者相關(guān)性的研究還不多。以54株從臨床分離的大腸埃希菌為研究對象，測定菌株對7種氨基糖苷類(lèi)抗生素的最低抑菌濃度(MIC)及檢測其產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)，為臨床合理有效地應用抗生素提供依據；同時(shí)克隆aac(3)-II基因到pET26b，檢測重組菌BL21(DE3)/pET26：：aac(3)-II對氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥譜，為進(jìn)一步研究aac(3)-II基因奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 實(shí)驗菌株及質(zhì)粒
收集從2005年2～8月溫州醫學(xué)院附屬第一醫院臨床送檢的血液、腹水、尿液等無(wú)菌體液標本分離得到的大腸埃希菌，紙片法測定其對慶大霉素(gentamicin，抑菌圈直徑≤
1.2 體外最低抑菌濃度的測定
采用瓊脂稀釋法測定阿米卡星(amikacin A)、慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素(kanamycin)、奈替米星(netilmicin)、大觀(guān)霉素(spectinomycin)、鏈霉素(streptomycin)對54株大腸埃希菌的MIC，以大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，按CLSI/NCCLS(2004)版解釋實(shí)驗結果［2］。
1.3 超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的檢測
ESBLs的檢測采用NCCLS推薦的酶抑制劑增強紙片擴散法。頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟/克拉維酸(CD3)、頭孢他啶/克拉維酸(CD2)紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品。單藥紙片(CTX、CAZ)與相應的含酶抑制劑紙片(CD3、CD2)中任何一對的抑菌環(huán)直徑之差≥
1.4 質(zhì)粒的提取及轉化
用質(zhì)粒提取試劑盒提取臨床分離菌株WYD1094、WYD1102的質(zhì)粒，并轉化到感受態(tài)細胞BL21(DE3)，涂布于含慶大霉素(8μg/ml)的LB固體培養基中，挑取生長(cháng)的單個(gè)菌落，并分別記作為BL21/WYD1094，BL21/WYD1102。提取轉化菌的質(zhì)粒，1.0%瓊脂糖凝膠電泳。按“
1.5 氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因aac(3)-II的檢測
自行設計aac(3)-II基因引物，并在引物上添加酶切位點(diǎn)，上游引物5′-GGCATATGATFCATACG-CGGCAAGGCAAT-3′(下劃線(xiàn)處為NdeI酶切位點(diǎn))，下游引物5′-TTCCCCTCGAGCTAACCGG-AAGGCTCGCAGG-3′(下劃線(xiàn)處為XhoI酶切位點(diǎn))，PCR產(chǎn)物長(cháng)度為877bp。采用堿裂解法提取細菌質(zhì)粒DNA。50μl的PCR反應體系中包括：10×反應緩沖液5μl、5mmo/LMgC12 3μl、2.5mmol/L的4種dNTPs Mix 4μl、引物(20μmol/L)各2μl、Taq DNA聚合酶2.5U和模板2.5μl。PCR反應條件：
1.6 aac(3)-II基因的克隆及重組菌的耐藥譜
選取一份PCR陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)純化回收，NdeI和XhoI雙酶切后與經(jīng)相同雙酶切后的表達載體pET26b連接；連接產(chǎn)物轉化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞并涂布到含卡那霉素25μg/ml的LB固體培養基中；挑取生長(cháng)的單個(gè)菌落，經(jīng)PCR和NdeI-XhoI雙酶切證實(shí)為重組菌BL21(DE3)/pET26：：aac(3)-II；采用瓊脂稀釋法測定上7種氨基糖苷類(lèi)抗生素的MIC，同時(shí)以BL21(DE3)和BL21(DE3)/pET26b為對照，大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，結果解釋同前。
2 結果
2.1 大腸埃希菌對7種氨基糖苷類(lèi)抗生素的MIC
紙片法示54株大腸埃希菌對慶大霉素、卡那霉素和妥布霉素其中一種或以上耐藥。54株大腸埃希菌對7種氨基糖苷類(lèi)抗生素的MIC結果如表1所示。
2.2 大腸埃希菌對阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素的耐藥表型及產(chǎn)ESBLs的檢測結果
54株大腸埃希菌對三種氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥表型如表2所示。用NCCLS推薦的ESBLs表型確證法檢測到34株陽(yáng)性菌株，占63.0%。 表1 54株大腸埃希菌對7種氨基糖苷類(lèi)抗生素表2 54株大腸埃希菌對三氨基糖苷類(lèi)抗生素的
2.3 臨床分離菌的質(zhì)粒轉化菌結果
2株轉化菌的質(zhì)粒經(jīng)提取、電泳后均示一條條帶；對氨基糖苷類(lèi)抗生素的MIC如表3所示；同時(shí)均產(chǎn)ESBLs。
2.4 aac(3)-II基因的PCR及測序結果
在54株大腸埃希菌中共檢測出PCR陽(yáng)性45株(占83.3%)；陽(yáng)性產(chǎn)物均經(jīng)測序并在GenBank與已登錄的序列作比對，結果一致。
2.5 aac(3)-II基因的克隆及重組菌的耐藥譜結果
重組菌經(jīng)PCR和雙酶切后證實(shí)，aac(3)-II基因成功克隆并轉化，重組菌對氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥結果如表3所示。 表3 2株質(zhì)粒轉化菌及重組菌對7種氨基糖苷類(lèi)抗生素的MIC(μg/ml)
3 討論
(1)氨基糖苷類(lèi)抗生素是一類(lèi)由氨基環(huán)醇、氨基糖與糖組成的抗生素的總稱(chēng)，包括慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、鏈霉素等。氨基糖苷類(lèi)抗生素依賴(lài)電子轉運，通過(guò)細菌內膜到達胞質(zhì)中，與核糖體30S亞基結合。雖然這種結合并不阻止起始復合物的形成，但能通過(guò)破壞控制翻譯準確性的校讀過(guò)程來(lái)干擾新生鏈的延長(cháng)，導致細菌的死亡［3］。由于氨基糖苷類(lèi)抗生素在臨床上和動(dòng)物細菌性疾病的預防與治療中長(cháng)期和不合理的應用，使細菌對其耐藥性顯得日益突出。在本研究中，從臨床分離的大腸埃希菌對慶大霉素的耐藥率最高，達到77.8%，其次為妥布霉素(66.7%)和卡那霉素(59.3%)，對阿米卡星的耐藥率最低(14.8%)，這可能與阿米卡星是經(jīng)過(guò)結構改造、能抵抗氨基糖苷修飾酶的半合成氨基糖苷類(lèi)抗生素有關(guān)［3］。本研究結果與姚蕾等［4］報道的2004年北京地區大腸埃希菌耐氨基糖苷類(lèi)抗生素的結果基本相似，但卡那霉素的耐藥率比姚蕾等報道的高(北京地區為40.6%)，這可能與不同地區有不同的用藥習慣有關(guān)。大腸埃希菌對奈替米星的耐藥只有22.2%，但對其中度敏感的比率卻達50.0%，這可能是因為奈替米星作為第三代氨基糖苷類(lèi)抗生素在結構上作了改進(jìn)，使得AAC(3)-II對奈替米星的修飾作用受到部分限制但不能完全排除影響［3］。54株大腸埃希菌中有8株細菌對阿米卡星耐藥，其中有7株為高水平耐藥(MIC≥512μg/ml)且對其他6種氨基糖苷類(lèi)抗生素也有較高水平的MIC值(均MIC≥128μg/ml)，顯然，這種對幾乎所有氨基糖苷類(lèi)抗生素高水平的耐藥現象可能存在有多種耐藥機制或高水平耐藥機制，如16S rRNA甲基化酶［5］。
(2)超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)是指由質(zhì)粒介導的能賦予細菌對頭孢菌素類(lèi)、氨曲南以及青霉素類(lèi)廣泛耐藥的一類(lèi)酶。有學(xué)者認為［6］，以亞胺培南為代表的碳青霉烯類(lèi)抗生素對細菌所產(chǎn)的大部分β-內酰胺酶穩定，氨基糖苷類(lèi)抗生素對這一類(lèi)細菌亦然，特別是對阿米卡星耐藥率在20%。在治療由產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌感染時(shí)可以采用氨基糖苷類(lèi)抗生素加頭霉烯類(lèi)抗生素，或氨基糖苷類(lèi)抗生素加β-內酰胺酶抑制劑類(lèi)抗生素聯(lián)合用藥方案。段建春等報道［7］，在產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌中aac(3)-II基因的檢出率高達80%。在本研究中，共有34株細菌產(chǎn)ESBLs，其中有30株為aac(3)-II基因陽(yáng)性，占88.2%；在45株aac(3)-II基因陽(yáng)性的細菌中，有30株產(chǎn)ESBLs(占66.7%)，這個(gè)比例比一般的大腸埃希菌中產(chǎn)ESBLs檢出率高［8］。將臨床分離菌的質(zhì)粒轉化到BL21中，提取質(zhì)粒并電泳后示僅單一條帶；同時(shí)檢測到aac(3)-II基因和產(chǎn)ESBLs，說(shuō)明這兩種基因在同一個(gè)質(zhì)粒上。Patterson等［9］認為氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因與ESBLs基因可在同整合子上，表現出多重耐藥。由于在本實(shí)驗中沒(méi)有作整合子的檢測，所以不能認為它們在同一整合子上，但可以認為這兩個(gè)基因很可能會(huì )同時(shí)隨著(zhù)質(zhì)粒而傳播耐藥性。因此在治療產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌時(shí)，應考慮其可能同時(shí)攜帶有aac(3)-II基因或其他氨基糖苷修飾酶基因，避免使用此類(lèi)抗生素。
(3)到目前為止，細菌對氨基糖苷類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥的分子機制主要有以下五種：①細菌產(chǎn)生一種或多種修飾酶，使進(jìn)入細菌胞內的抗生素失去生物活性；②抗生素作用靶位的改變、核糖體堿基發(fā)生變化或與核糖體結合的核蛋白氨基酸發(fā)生突變，使抗菌藥物無(wú)法發(fā)揮作用；③細菌細胞膜通透性改變，使進(jìn)入胞內的抗菌藥物減少；④細菌通過(guò)主動(dòng)外排(active efflux)機制將已進(jìn)入胞內的藥物泵至胞外；⑤細菌產(chǎn)生16S rRNA甲基化酶。細菌對氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥主要是由于產(chǎn)生了一種或多種氨基糖苷類(lèi)修飾酶(AMEs)。AMEs分為三大類(lèi)，即乙酰轉移酶(AAC)、核苷轉移酶(ANT)和磷酸轉移酶(APH)。此類(lèi)酶作用于氨基糖苷類(lèi)抗生素特定的氨基或羥基，使抗生素發(fā)生鈍化，使其降低或喪失對靶位核糖體的親和力［10］。產(chǎn)AAC(3)-II是大腸埃希菌對氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥中最常見(jiàn)的耐藥機制之一［4］。在本研究的54株對氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥的大腸埃希菌中，aac(3)-II基因的檢出率為83.3%(45/54)。根據氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥性分為三種耐藥表型(表2)：G-T型、G型和G-T-A型，其中G-T型占多數且全部檢出aac(3)-II基因，這與孔海深等［11］報道的結果相類(lèi)似。這種耐藥表型與基因型并不完全一致的原因可能是由于氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因多數由整合子介導，且一個(gè)整合子可攜帶多個(gè)修飾酶基因［12］；耐藥基因盒的表達不僅依賴(lài)于啟動(dòng)子的強弱，而且與啟動(dòng)子的距離遠近有關(guān)：上游基因表達強，下游基因表達弱甚至不表達［13］。6株對慶大霉素敏感且檢出aac(3)-II基因的大腸埃希菌的藥敏結果顯示，這6株對奈替米星、卡那霉素、鏈霉素、大觀(guān)霉素、阿米卡星和妥布霉素中的一種或多種耐藥。有學(xué)者［3］認為aac(3)-II基因可以以沉默狀態(tài)存在，表現為不耐藥；同時(shí)修飾酶在細胞內的定位也可能使有該酶基因的檢出但不表現為耐藥；而對奈替米星和妥布霉素等AAC(3)-II底物的耐藥可能是由于這些菌株中存在的其他耐藥機制所致，如產(chǎn)AAC(6′)-I。
(4)在本研究中，成功地克隆了一株aac(3)-II基因的重組菌BL21/pE26b：：aac(3)-II。重組菌的藥敏試驗發(fā)現，重組菌對慶大霉素和卡那霉素有耐藥性，對奈替米星和妥布霉素以及其他氨基糖苷類(lèi)抗生素沒(méi)有產(chǎn)生耐藥性。這可能是aac(3)-II基因在重組狀態(tài)下所產(chǎn)生的重組蛋白在蛋白的正確折疊、二硫鍵形成與天然蛋白質(zhì)有一定的差別，使酶的活性發(fā)生了改變。由于慶大霉素的結構較妥布霉素等簡(jiǎn)單，其I環(huán)3位氨基處于沒(méi)有其他空間阻隔的狀態(tài)，易被修飾酶所攻擊［3］；同時(shí)現在也有學(xué)者認為妥布霉素與核糖體結合的部位不止一個(gè)，妥布霉素可以以對稱(chēng)或不對稱(chēng)的方式二聚體化后以擴大范圍，這樣減少修飾酶對妥布霉素的修飾作用而發(fā)揮抗菌能力［14］。
綜上，大腸埃希菌對氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥譜中，對慶大霉素的耐藥率最高(77.8%)，對阿米卡星最低(14.8%)。在對氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥的大腸埃希菌中，ESBLs的檢出率較高(63.0%)，為臨床上合理選擇和使用抗生素提供實(shí)驗依據。
作者：陳云波 王震 查長(cháng)森 鄒立林 季敬章 彭穎 呂建新《中國抗生素雜志》
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