金銀花二氧化碳超臨界萃取物的體外抑菌作用研究

【摘要】  目的研究金銀花CO2超臨界萃取(SFE)物的體外抑菌作用。方法采用瓊脂擴散法和試管稀釋法研究金銀花的5種提取工藝，即SFE萃取、SFE-C萃取(C表示帶夾帶劑)、乙醇提取、超聲波提取、共水蒸餾（SD）法提取，所得提取原液藥物對6種細菌，即金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色葡萄球菌、綠膿桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抑菌作用。結果5種提取原液藥物對6種細菌均有一定抑制作用，而且SFE萃取物對綠膿桿菌的MIC 為1∶16；SFE-C萃取物對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的 MIC 均為1∶16。結論與傳統的提取方法相比，采用SFE-C和SFE工藝得到的萃取物含非綠原酸類(lèi)熱敏抗菌物質(zhì)，提高了金銀花的抗菌效果。

【關(guān)鍵詞】  金銀花 二氧化碳超臨界萃取 夾帶劑 體外抑菌

    Abstract：ObjectiveTo research the growth inhibition of CO2-SFE extracts from Lonicerae on bacteria in vitro. MethodsThe agar diffusion and tube dilution methods were used to study the growth on bacteria inhibition of the Lonicerae extracts with five different kinds of extraction approaches, which were SFE extraction, SFE-C extraction, alcohol extraction, ultrasonic extraction and SD extraction, by applying them to the following bacteria: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus albus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium. ResultsAll Lonicerae extracts with five kinds of extractions were effective to the bacteria;the MIC against Pseudomonas aeruginosa of SFE extracts was 1∶16；The MIC against Staphylococcus aurous and Pseudomonas aeruginosa of SFE-C extracts was 1∶16. ConclusionCompared with the conventional extractions methods, the extracts with SFE-C extraction and SFE extraction include the heat-sensitive substances which would enhance the inhibiting bacteria ability.

    Key words：Lonicerae;   CO2 Supercritical extraction;   Cosolvent;   In vitro inhibition

    金銀花為忍冬科Caprifoliaceae忍冬屬Lonicera植物的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，為中醫常用藥，具有清熱解毒、涼風(fēng)散熱之功效［1］�，F代藥理研究表明金銀花具有較為廣泛的藥理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎解熱、保肝、抗生育、抗氧化、止血等，這些研究為金銀花的臨床用藥提供了科學(xué)依據，但所確定的有效部位均是水提取物或醇提取物［2，3］，有效成分不夠明確和具體，因此難以建立有效的質(zhì)量控制方法。

    針對以上不足，我們采用不同的提取工藝，對金銀花加入夾帶劑CO2超臨界（SFE-C）萃�。�4］、未加夾帶劑CO2超臨界(SFE)萃�。�5］、乙醇醇提�。�6］、超聲波提取、共水蒸餾法（SD）提�。�7］5種提取原液藥物中的揮發(fā)油類(lèi)、黃酮類(lèi)及綠原酸類(lèi)成分分別進(jìn)行了富集處理，采用瓊脂擴散法和試管稀釋法對各個(gè)提取物進(jìn)行了體外抑菌實(shí)驗研究。

    1  儀器與材料

    1.1  藥品JYH-1(采用SFE-C工藝提取物，其中JYH-X表示第x種金銀花提取物，后面括號給出提取工藝說(shuō)明)：山東產(chǎn)金銀花藥材，烘干，研碎，再放入萃取釜，加入夾帶劑，在35 ℃下，萃取 2 h，將萃取物中溶劑夾帶劑旋轉蒸發(fā)除掉得到萃取物（萃取率為18.61 ％，綠原酸得率為 69.52 ％）。

    1.1.1  JYH-2(SFE萃取物)山東產(chǎn)金銀花藥材，烘干，研碎，再放入萃取釜中，在萃取溫度為 35 ℃下，萃取時(shí)間 2 h，得萃取物揮發(fā)油（萃取率為1.08 ％）。

    1.1.2  JYH-3(醇提綠原酸)山東產(chǎn)金銀花藥材，烘干，研碎，10倍量的75 ％ 乙醇回流2次，60℃，0.5 h/次，再回收乙醇，水浴濃縮，蒸餾水洗入100 ml容量瓶，定容得到綠原酸提取物（得率為79.43 ％）。

    1.1.3  JYH-4(超聲波提取黃酮)山東產(chǎn)金銀花藥材，烘干，研碎，放入錐形瓶中，加入95 % 乙醇50 ml，在冰水浴中用超聲波振蕩器振蕩20 min，將提取液過(guò)濾至100 ml容量瓶中，殘渣再重復振蕩提取2次，將3次的濾液合并，在水浴上減壓蒸餾得到黃酮提取物（黃酮的含量為0.002 9%）。

    1.1.4  JYH-5(SD法提取揮發(fā)油)取金銀花適量，參照2005年版《中國藥典》Ⅰ部的方法用水蒸氣蒸餾法提取金銀花揮發(fā)油，提取時(shí)間6 h，得到金銀花揮發(fā)油（得率為 0.025%）。

    1.2  培養基

    1.2.1  固體培養基 牛肉膏蛋白胨細菌培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉提取物3.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 ml，pH 7.0。

    1.2.2  肉湯培養基蛋白胨10.0 g，牛肉提取物3.0 g，氯化鈉5.0 g，蒸餾水1 000 ml，pH 7.0。

    1.3  菌株所用菌株包括由浙江工業(yè)大學(xué)生物制藥研究所提供的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌以及由中國科學(xué)院微生物研究所購得的綠膿桿菌、白色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌共6種。

2  方法

    2.1  測藥物的抑菌圈直徑定性分析藥物的抗菌作用采用瓊脂擴散法［8］。每平皿加0.1 ml 菌液（菌液濃度為 1.0×105 cfu/ml），涂布整個(gè)培養基表面，37 ℃，吸附 30 min。然后上面均勻放置 4 個(gè)直徑約為 6 mm 的無(wú)菌不銹鋼牛津杯。然后用移液器在孔中加藥液 200 μl；37 ℃恒溫培養箱內培養 24 h 后，觀(guān)察并記錄抑菌圈的有無(wú)及其直徑大�。ㄖ貜� 2 次，每次做 4 孔，求直徑的平均值）。

    2.2  定量測量藥物對細菌的最低抑菌濃度 (MIC) 及最小殺菌濃度 (MBC)采用試管稀釋法，（每種藥物每種菌）用無(wú)菌小試管11只排于試管架，第1只不加肉湯培養基，第2～11管各加1 ml；于第1只試管中加入配置好的藥液2 ml，然后取 1 ml 加入第2管，混勻后取1 ml 加入第3管，依次倍比稀釋?zhuān)�自�?SPAN lang=EN-US>10管吸出1 ml 棄去，第11管系對照管。將各管中加入已校正濃度的菌液（1.0×105 cfu/ml）0.1ml，混勻后放置37 ℃培養24 h ，觀(guān)察結果，找出阻止細菌生長(cháng)的最低藥物濃度，3次實(shí)驗結果的平均值即為金銀花的最小抑菌濃度（MIC）。將MIC以上濃度的培養基各濃度取 0.1 ml傾注瓊脂培養基（每濃度做3皿），37 ℃，24 h后，觀(guān)察細菌生長(cháng)情況，以每藥物最低無(wú)菌生長(cháng)濃度（3皿都無(wú)菌生長(cháng)）來(lái)判斷各藥物的最低殺菌濃度（MBC）。

    3  結果

    3.1  藥物的抗菌作用JYH-1，JYH-2，JYH-3，JYH-4和JYH-5這5 種提取原液藥物的生藥含量分別為5.4，92.6，1，2.6，4.0 kg /ml。按照實(shí)驗方法“2.1”，對6種細菌做抗菌實(shí)驗。實(shí)驗結果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，5種提取原液藥物對6 種細菌均有一定抑制作用。表1  各種金銀花提取物抑菌圈直徑的比較“-”表示無(wú)抑菌圈；n＝8

    3.2  藥物對細菌的最低抑菌濃度 (MIC) 及最小殺菌濃度 (MBC)按照“2.2”項下方法進(jìn)行實(shí)驗。結果見(jiàn)表2～3。表2顯示，醇提綠原酸抑菌效果最顯著(zhù)，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌的MIC均為1∶16；SFE-C 萃取物對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌抑菌作用較強，其MIC均為1∶16；SFE萃取物對綠膿桿菌作用較強，其MIC為1∶16；SD揮發(fā)油抑菌作用最差，說(shuō)明SFE萃取物揮發(fā)油強于SD揮發(fā)油抑菌效果，SFE萃取物揮發(fā)油也有一定的抑菌效果。表2  各種金銀花提取物最小抑菌濃度表3  各種藥物最小殺菌濃度 “-”表示無(wú)最小殺菌濃度

    表3顯示，醇提物（綠原酸含量79.4％）殺菌效果最顯著(zhù)，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的MBC 均為1∶8，SFE-C 萃取物對綠膿桿菌抑菌作用較強，其MBC 為1∶8；而超聲提取黃酮和SD 揮發(fā)油殺菌作用弱，說(shuō)明SFE-C 萃取物（其中綠原酸占26 ％，是醇提物的1/3）殺菌效果強于超聲提取黃酮和SD 揮發(fā)油，接近于醇提綠原酸殺菌效果，綜合考慮綠原酸含量，MBC，MIC，表明SFE-C 萃取物中含有醇提物中所沒(méi)有的非綠原酸類(lèi)抑菌物質(zhì)；文獻報道［9］金銀花中有熱敏性抑菌成分。SFE-CO2可較好地避免熱敏成分破壞 (本文采用35℃)。本部分結果提示，金銀花中含非綠原酸類(lèi)熱敏抑菌物質(zhì)，使金銀花的抑菌效果提高。

    4  結論

5種提取原液藥物對6 種細菌均有一定抑制作用， SFE-C萃取物對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的 MIC 均為1∶16；SFE萃取物對綠膿桿菌的MIC 為1∶16。綜合考慮綠原酸含量，MBC，MIC，可知SFE萃取物和SFE-C 萃取物中含有醇提物中所沒(méi)有的非綠原酸類(lèi)抑菌物質(zhì)。金銀花中含非綠原酸類(lèi)熱敏抑菌物質(zhì)，使金銀花的抗菌效果提高。這方面工作值得進(jìn)一步研究。

作者：蘇香萍 龔大春 張亞雄 龔美珍《時(shí)珍國醫國藥》

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