豬鏈球菌的分離與鑒定

摘 要

2000年4月，陜西省岐山縣種豬繁育場(chǎng)仔豬流行關(guān)節炎和敗血癥。無(wú)菌采取患關(guān)節炎豬的關(guān)節液和患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結各8份病料，并對這16份病料進(jìn)行病原菌分離試驗、血清學(xué)鑒定、致病力試驗、保護力試驗、細菌回收試驗、藥敏試驗。結果表明：該病原菌為2型豬鏈球菌，引起關(guān)節炎的豬鏈球菌較引起敗血癥的豬鏈球菌致病力弱；該菌對頭孢菌素、青霉素高度敏感。

 

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌 分離鑒定

前 言

豬鏈球菌（Streptococcosis suis）是豬的一種重要疾病，養豬業(yè)發(fā)達國家如美、英、荷及愛(ài)爾蘭等常有本病發(fā)生。我國于1958年就有豬鏈球菌病的報道，1976年我國南方幾省曾一度廣泛流行，給我國養豬業(yè)帶來(lái)了很大危害。

豬鏈球菌截止到目前已發(fā)現的莢膜型已超過(guò)30種[1]。我國于1995年首例鑒定證實(shí)2型豬鏈球菌在我國的存在 [2]。豬鏈球菌可致2—6周齡仔豬敗血癥、腦膜炎、關(guān)節炎及支氣管肺炎等[3-7]。病豬和帶菌豬是本病的重要傳染源，病豬的鼻液、尿液、血液、肌肉、內臟和關(guān)節內均可檢出病原體。未經(jīng)無(wú)害處理的病死豬肉、內臟及廢棄物是散播本病的重要原因，呼吸道是本病的主要傳播途徑。本病一年四季均可發(fā)生，但以4—10月份發(fā)生較多。本病常為地方性流行性，多呈敗血性。短期波及全群，如不進(jìn)行防治，則發(fā)病率、病死率很高，慢性常為地方性散發(fā)性傳染。

2000年4月，岐山縣種豬繁育場(chǎng)仔豬流行關(guān)節炎及敗血癥，多為2—6周齡仔豬。無(wú)菌采取關(guān)節炎病豬的關(guān)節液及敗血癥病豬的肝、脾、肺及腸系膜淋巴結，經(jīng)實(shí)驗室分離鑒定，證實(shí)為2型豬鏈球菌�，F將分離鑒定結果報告如下。

 

1． 實(shí)驗材料

 

1． 1病料 無(wú)菌采取岐山縣種豬繁育場(chǎng)患關(guān)節炎病豬的關(guān)節液8份，編號為1—8號，無(wú)菌采取患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結8份，編號為9—16號。

 

1． 2試劑 試驗所用的各種糖均購自上�；瘜W(xué)試劑二廠(chǎng)，批號自95—98年不等。

1． 3培養基 綿羊鮮血平板、匹克氏增菌液、10ml/L豬血清肉湯及各種糖培養基按常規方法制備[8]。

1． 4血清學(xué)試驗 豬鏈球菌診斷血清與平板凝集抗原均購自中國獸藥鑒察所，批號為990705。

1． 5藥敏紙片 購自浙江省軍區后勤部，批號20000312。

1． 6試驗動(dòng)物 健康小白鼠（30—35g）50只，購自第四軍醫大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心。

 

2． 方法

 

2． 1 病原分離

 

將所采病料分別涂片，革蘭氏染色鏡檢，然后，分別接種鮮血瓊脂平板。37℃需氧培養24h后，挑取可疑菌落接種于匹克氏增菌液，37℃培養24h后，革蘭氏染色，顯微鏡檢查，再接種血清肉湯，純化后放置4℃，冷藏備用。

2．2 分離菌株的鑒定

2．2．1生化試驗

隨機抽取上述分離菌血清肉湯培養物3#、8#、13#、15#，分別接種于蔗糖、山梨醇、棉實(shí)糖、葡萄糖、甘露糖、蕈糖、乳糖、菊糖、水楊苷、馬尿酸鈉培養基，37℃培養24h后，觀(guān)察其對糖的利用情況。

2．2．2血清學(xué)鑒定

 

將3#、8#、13#、15#菌經(jīng)緩沖肉湯培養8h，通過(guò)3000r/min離心10min，PBS洗滌2次，用Ph7.2 的0.01mol/L PBS制成 1*10 10~2*10 10細菌懸液。取1滴上述細菌懸液與適當的抗血清在潔凈玻片上混勻，立即觀(guān)察凝集現象。同時(shí)，設立細菌懸液對照及血清對照。

 

2．3 致病力及保護力試驗

2．3．1菌落形成單位的測定 按常規方法進(jìn)行[9]

2．3．2致病力試驗

無(wú)菌吸取上述血清肉湯培養物（含菌量5.0*10 8CFU/ml）以0.1ml /只、0.2ml/只、 0.3ml/只、 0.4ml /只、0.5ml/只分別腹腔注射小白鼠2只，觀(guān)察其死亡時(shí)間和數量，測定其最小致死量。再將上述血清肉湯培養物腹腔注射小白鼠，小白鼠共14只，分7 組。第一組，每只小白鼠注射3#菌0.2ml，第二組每只注射8#菌0.2ml，第三組每只注射3#、8#菌各0.1ml，第四組每只注射13#菌0.2ml，第五組每只注射15#菌0.2ml，第六組每只注射13#、15#菌各0.1ml，第七組每只注射無(wú)菌血清肉湯1.0ml。以上各組分別飼養觀(guān)察其死亡時(shí)間及數量。

 

2．3．3保護力試驗

將3#、8#、13#、15#血清肉湯培養物分別接種于18 cm鮮血平板。37℃培養24h后，收菌，用麥氏比濁管比濁，適當稀釋?zhuān)�然后�?.3%甲醛滅活；37℃作用24h；作無(wú)菌檢驗。然后分別腹部皮下接種小白鼠2只，0.4ml/ 只。10天后，再分別人工感染，0.2ml/只。

 

2．3．4細菌回收試驗

對致病力試驗出現癥狀及死亡小白鼠剖檢，并采集病料，進(jìn)行分離。

 

2．4藥敏試驗

采用紙片擴散法，用無(wú)菌棉簽蘸取分離菌的血清肉湯培養物，均勻涂布于9cm鮮血平板；待稍干后，用無(wú)菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼在培養基表面，4℃2h使藥物擴散，然后置37℃培養20—24h，觀(guān)察結果。結果按抑菌圈直徑大小和各抗菌藥的具體標準，評定為高度敏感、中度敏感或耐藥。結果評定參照表1。

表 1 各種抗菌藥物的抑菌圈與敏感標準

3．結果

3．1分離細菌的培養特性及形態(tài)特征

3．1．1培養特性

37℃培養24h后，所采的12份病料在鮮血瓊脂平板上形成表面光滑、隆起的灰綠色小菌落，外層有明顯的β溶血環(huán)。該菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉湯中先均勻渾濁，后在試管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。

3．1．2染色特性

關(guān)節液、鮮血瓊脂、匹克氏增菌液及血清肉湯培養物涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查為革蘭氏陽(yáng)性，在關(guān)節液、鮮血瓊脂培養物中多呈單個(gè)、雙球或短鏈狀排列，在匹克氏增菌液及血清肉湯培養物中多呈長(cháng)鏈狀。

3．2生化試驗結果（見(jiàn)表2）

表2 分離菌生化試驗結果

判定標準：“+”表示大多數（90%—100%）菌株為陽(yáng)性；“-”表示大多數（90%—100%）菌株為陰性。

 

表2表明分離的3#、8#、13#、15#菌的生化反應結果均符合豬鏈球菌的生化特性，說(shuō)明分離的菌均為豬鏈球菌。

3．3 血清學(xué)鑒定結果

將3#、8#、13#、15#細菌懸液與1/2及2型抗血清混合，立即可見(jiàn)明顯的凝集現象，但不與1型及其他型抗血清出現凝集。直接挑取細菌菌落與血清混勻，也能得到一致結果。陰性對照均未見(jiàn)凝集現象。

3．4 致病力試驗結果及保護力試驗結果

3．4．1致病力試驗結果

第一組、第二組小白鼠注射血清肉湯培養物48h內均未見(jiàn)死亡，第三組48h內有一只死亡，第四組、第五組、第六組在注射血清肉湯培養物18h內全部死亡。死亡后，小白鼠皮膚發(fā)紺，剖檢肝、脾、肺、心出血，呈敗血癥。第七組健活。由于第一、二、三組死亡數量非常少，所以，再用相同劑量分別背部皮下接種小白鼠各2只，48h后處死，剖檢發(fā)現注射部位有直徑0.9~1.1cm的膿腫，濃汁呈黃綠色。

3．4．2保護力試驗結果 免疫的小白鼠再經(jīng)攻毒后均未發(fā)病。

3．5細菌回收試驗結果

將上述死亡及發(fā)病的小白鼠剖檢采集病料，進(jìn)行細菌分離、生化試驗及血清學(xué)鑒定，能得到原分離菌。

3．6藥敏試驗結果（見(jiàn)表3）

 

表3 藥敏試驗結果

 

表3表明，結果敏感的藥物依次是：頭孢菌素、青霉素；中度敏感的依次是：潔霉素和卡那霉素；而對土霉素、鏈霉素、慶大霉素具有抗藥性。

 

4．分析與討論

 

4．1 豬鏈球菌（Streptoccus suts）是危害養豬業(yè)的一種重要病原菌。80年代初，加拿大由豬鏈球菌引起的疾病開(kāi)始增加。那時(shí)僅檢出9種夾膜血清型，其中2型是最常見(jiàn)的。

4．2 豬鏈球菌病在臨床上有敗血型、腦膜腦炎型、關(guān)節炎型支氣管炎型等。過(guò)去屢有敗血型豬鏈球菌的報道，而關(guān)于集約化養豬場(chǎng)關(guān)節炎型鏈球菌病的報道較少。本次試驗從患關(guān)節炎豬的關(guān)節液中成功的分離出了豬鏈球菌。另外，岐山種豬場(chǎng)，約有60%的仔豬流行關(guān)節炎，嚴重者可發(fā)生敗血癥而死亡，給種豬場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟損失。所以，研究本病可為生產(chǎn)中防制本病提供理論依據。

 

4．3 病豬和帶菌豬是本病的重要傳染源。病豬的鼻液、尿液、肌肉、內臟和關(guān)節內均帶有病原體，所以，我們建議，首先應加強對健康豬的免疫。另一方面，在發(fā)病后，加強病豬和健康豬的隔離，根據實(shí)驗室所做的藥敏試驗結果，配合藥物治療，建議用頭孢菌素、青霉素、潔霉素等藥物治療。岐山縣種豬繁育場(chǎng)采納我們的建議后，首先對所有的未發(fā)病仔豬用滅活疫苗免疫接種，對已發(fā)病的豬用青霉素等藥物配合治療。另外，注意衛生管理。目前該病已得到有效的控制。

 

4．4 從致病力試驗結果可以看出，引起豬關(guān)節炎的豬鏈球菌的致病力較小，而引起敗血癥的豬鏈球菌的致病力較強。但通過(guò)生化試驗和血清學(xué)鑒定，它們又是同種細菌且血清型也相同。為什么同種血清型的豬鏈球菌的致病力差別很大？這個(gè)問(wèn)題還有待于進(jìn)一步研究。

作者：朱鳳才 楊華富 胡曉

參考文獻

 [1] 楊本升，劉玉斌，茍仕金等． 動(dòng)物微生物學(xué)． 吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1995

[2] 張庚華．豬鏈球菌感染最新研究進(jìn)展．國外獸醫學(xué)—畜禽疾病，1995，16（2）：31

[3] 黃毓茂,黃引賢．2型豬鏈球菌的血清學(xué)鑒定．中國獸醫學(xué)報，1995，15（1）：63—65

[4] Gottschalk M.J Clin Microbiol，1989，27：2633—2636

[5] Higgins R et al．Can J vet Res，1990，54：170—173

[6] Sanford S E.JAVMA，1982，181：673—676

[7] Wiadsor.Vet Rec，1977，101：378—379

[8] 李健強. 獸醫微生物學(xué)實(shí)驗與實(shí)習指導．西北農業(yè)大學(xué)，1996

[9] 張彥明，賈靖國，劉安典．動(dòng)物性食品衛生檢驗技術(shù)．西北大學(xué)出版社，1996

[10] 蔡寶祥．家畜傳染病學(xué)．北京，中國農業(yè)出版社，1998

[11] 甘肅農業(yè)大學(xué)主編，獸醫微生物學(xué)．北京，中國農業(yè)出版社，1982

[12] 劉榮標．獸醫微生物學(xué)（上）．臺北，藝軒圖書(shū)出版社，中華民中73 年

[13] 鄭明球．家畜傳染病學(xué)實(shí)驗指導．北京， 中國農業(yè)出版社，1999

[14] 甘肅農業(yè)大學(xué)主編．獸醫微生物學(xué)（第二版）．中國農業(yè)出版社，1998

[15] 郝天斌，陳雨田．豬非溶血性關(guān)節炎型鏈球菌病的診治．中國獸醫科技．1999，29（3）：34—35

[16] 陳書(shū)琨，林慶燕．豬鏈球菌生化突變株的分離與鑒定

[17] 汪誠天，葉祝年，一支方等．獸醫實(shí)驗手冊．上�？茖W(xué)技術(shù)出版社，1984