黃藤素片微生物檢驗方法驗證中加菌方法的比較研究

�。壅�要］ 目的：比較黃藤素片微生物方法驗證中的加菌方法不同，所出現的回收率差異。方法：采用離心法薄膜過(guò)濾法棄除黃藤素片中的抑菌成分。結果：離心前加入陽(yáng)性對照菌所得回收率非常低，采用薄膜過(guò)濾法的陽(yáng)性對照菌所得回收率可達70%以上，兩者有顯著(zhù)性差異。結論：薄膜過(guò)濾法最后一次沖洗加入陽(yáng)性對照菌僅能說(shuō)明黃藤素片的抑菌作用可采用離心薄膜過(guò)濾法棄除，而不能反映該藥品在生產(chǎn)、運輸、貯藏過(guò)程所污染的微生物。

　�。坳P(guān)鍵詞］ 微生物方法驗證；抑菌作用；離心法薄膜過(guò)濾法

　　A study on the microbiology verifying test of Huangtengsu tablet with bacterial put in

　�。跘bstract］ Objective:To compare the different recovery rates resulted from different methods in putting bacterial in microbiology verifying test of Huangtengsu tablet. Methods: The centrifugalization and membrane filtration were used to get rid of the components restraining bacterial from Huangtengsu tablet. Results: The recovery rate of the bacterial put into drug before centrifugalization was evidently different from that after the last washing of membance filtration. Conclusions: The result of putting bacterial into drug after membrane filtration may not illustrate some bacterial contaminated in production, transportation and garner.

　�。跭ey words］ Microbiology verifying test; Bacteriostasis function; The centrifugalization and membrane filtration

   

　　2005版《中國藥典》在藥品微生物限度檢驗方法項下增加了方法學(xué)驗證的內容，特別對有抑菌作用的藥品指出可采用離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法或聯(lián)合使用這些方法消除抑菌作用，并要求陽(yáng)性菌的加入方法是最后一次濾膜沖洗時(shí)。針對黃藤素片的抑菌情況，筆者采用離心薄膜過(guò)濾法消除其抑菌，并就其加入陽(yáng)性對照菌的方法進(jìn)行了比較，發(fā)現加入陽(yáng)性對照菌的方法不同，所得到的回收率差異是非常顯著(zhù)的。

　　1  材料和方法

　　1.1  試驗材料

　　1.1.1  樣品  黃藤素片分別由玉溪維和制藥有限公司（批號20040113，樣品1）、昆明制藥有限公司（批號20040452，樣品2）、云南滇池制藥有限公司（批號20040701，樣品3）提供。

　　1.1.2  稀釋劑及培養基  無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）按藥典配制，TTC營(yíng)養瓊脂培養基、營(yíng)養肉湯培養基［1］均來(lái)源于北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司。

　　1.1.3  陽(yáng)性對照菌  大腸桿菌［CMCC（B）44102］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］［1，2］，由中國藥品生物制品檢定所提供。

　　1.2  方法

　　1.2.1  供試品的制備  分別取樣10 g，勻漿后加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）至100 mL，制成1∶10供試液備用［1］。

　　1.2.2  陽(yáng)性菌液制備  取相應菌株的營(yíng)養瓊脂培養基斜面新鮮培養物1白金耳，接種至營(yíng)養肉湯培養基內，培養18～20 h后用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）稀釋至相應的濃度［1］，備用。

　　1.2.3  試驗Ⅰ組  分別吸取1∶10約含50～100個(gè)/mL陽(yáng)性菌的供試液10 mL，置無(wú)菌離心管中，經(jīng)500 r/min離心5 min后，以無(wú)菌操作取上清液1 mL置無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）100 mL中，加入裝有直徑為50 mm、孔徑為（0.45±0.02）μm的微孔濾膜的過(guò)濾器內，減壓抽干后，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）沖洗濾膜3次，每次50～100 mL，取出濾膜，按上述操作分別進(jìn)行5次，各置5皿，再注入約45 ℃的TTC營(yíng)養瓊脂培養基約15 mL，混勻，37 ℃培養48 h后計數。

　　1.2.4  試驗Ⅱ組  分別吸取1∶10供試液10 mL置無(wú)菌離心管中，經(jīng)500 r/min離心5 min后，以無(wú)菌操作取上清液1 mL置無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）100 mL中，加入裝有直徑為50 mm孔徑為 (0.45±0.02)μm的微孔濾膜的過(guò)濾器內，減壓抽干后，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）沖洗濾膜3次，每次50～100 mL，最后一次沖洗時(shí)同時(shí)加入1 mL約含50～100個(gè)/mL陽(yáng)性菌菌液，取出濾膜，按上述操作分別進(jìn)行5次，各置5皿，再注入約45 ℃的TTC營(yíng)養瓊脂培養基約15 mL，混勻，37 ℃培養48 h后計數。

　1.2.5  供試品對照組  分別吸取1∶10的供試液10 mL，經(jīng)500 r/min離心5 min后，以無(wú)菌操作取上清液1 mL置無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）100 mL中，搖勻，以無(wú)菌操作加入裝有直徑為50 mm孔徑為（0.45±0.02）μm的微孔濾膜的過(guò)濾器內，減壓抽干后，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）沖洗濾膜3次，每次50～100 mL，取出濾膜，按上述操作分別進(jìn)行5次，各置5皿，再注入約45 ℃的TTC營(yíng)養瓊脂培養基約15 mL，混勻，37 ℃培養48 h后計數。

　　1.2.6  陽(yáng)性對照組  取制備好的約含50～100個(gè)/mL的陽(yáng)性菌菌液1 mL，置于平皿中，分別置5皿，再注入約45 ℃的TTC營(yíng)養瓊脂培養基約15 mL，混勻，37 ℃培養48 h后計數。

　　1.2.7  陰性對照組  取試驗用的稀釋液10 mL，照上述離心薄膜過(guò)濾法操作，作為陰性對照。

　　2  結果

　　2.1  藥典常規方法結果采用2005年版《中國藥典》［1］常規方法檢測三個(gè)批號黃藤素片陽(yáng)性菌回收率，在1∶10的稀釋級僅只有大腸桿菌加菌的回收率能達到70%以上，而在1∶10、1∶100的稀釋級加入其他三種標準菌，其回收率均遠遠低于70%。說(shuō)明樣品有很強的抑菌作用，因此黃藤素片的微生物限度檢測不能采用常規方法檢測。

　　2.2  不同加菌方法陽(yáng)性對照菌回收率由于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌在1∶10、1∶100的回收率無(wú)法達到藥典要求，且黃藤素片中含有一定的輔料，故改用離心薄膜過(guò)濾法測定。不同加菌方法陽(yáng)性對照菌回收率結果見(jiàn)表1、表2。

　　表1  試驗Ⅰ組陽(yáng)性對照菌回收率　略

　　表2  試驗Ⅱ組陽(yáng)性對照菌回收率組別　略

　　3  討論

采用離心薄膜過(guò)濾法消除黃藤素片的抑菌作用，若在離心前加入陽(yáng)性對照菌，4種陽(yáng)性標準菌的回收率非常低，這可能與離心沉降以及操作轉移過(guò)程中陽(yáng)性菌的損失和黃藤素片供試液對陽(yáng)性菌液存活率的影響有關(guān)。在薄膜過(guò)濾的最后一次沖洗時(shí)加入陽(yáng)性菌，上述4種陽(yáng)性菌的回收率均達到70%以上。兩種方法回收率的差距甚遠。在薄膜過(guò)濾法最后一次沖洗時(shí)加入陽(yáng)性對照菌，盡管回收率已達到了中國藥典2005版微生物限度檢驗驗證方法的要求，但這僅只能說(shuō)明該藥品的抑菌作用可采用離心薄膜過(guò)濾法去除，而不能反映該藥品在生產(chǎn)、運輸、貯藏過(guò)程中污染的微生物，因為所污染的微生物可能在棄除抑菌的處理過(guò)程中有損失。盡管采用離心薄膜過(guò)濾法棄除藥品中的抑菌作用是非常有效的處理辦法，但筆者認為本法僅考慮到消除藥品的抑菌作用而忽略了采用該法可能導致藥品在生產(chǎn)、運輸、貯藏過(guò)程污染的微生物在處理過(guò)程中損失的情況。鑒于微生物的特殊性，目前微生物檢驗方法非常局限，如何能既消除藥品的抑菌作用同時(shí)又能保證在生產(chǎn)、運輸、貯藏過(guò)程污染的微生物不損失，還有待進(jìn)一步研究。

 

作者：范兵，杜娟，陳林芳《兒科藥學(xué)雜志》

　　參考文獻：

　�。�1］ 藥典委員會(huì ). 中華人民共和國藥典(一部)［S］. 2005年版. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 附錄7173.

     ［2］ 馬緒榮, 蘇德模. 藥品微生物學(xué)檢驗手冊［M］. 北京: 科學(xué)出版社, 2000: 62, 6869, 82.